293T 细胞培养

293T细胞培养1.培养基:DMEM=丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：37度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml离心管，加5ml培养基，500g离心5min，弃上清，加1ml培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml左右，记得晃匀。3.传代:吸出旧培基，加5mlPBS洗一遍，用移液管加1ml胰酶，洗一遍吸出，37度放1min左右计时，看到大片大片脱落了即加入新培基吹打，吹洗充分后，吸1ml加到事先加好10ml新培育基的新瓶里。293T细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。293T细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。这三种方式均可用于293T细胞的大规模培养。293T细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM中能生长很好。一般来讲，1:10传代后，一周可以长满。严禁过度生长，这点很重要。因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。悬浮的293T细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。293T细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。293细胞培养特性：1、细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长,换液293T时动作要轻。一般用高糖的DMEM培养基。2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。12小时-24小时90%以上细胞贴壁。293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比例为1：3。3、293细胞在低代时容易贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，用PBS冲洗时即可能脱落，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液，最好购入时先大量冻存。4、复苏293细胞的另一生长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢。细胞冷冻后复苏时,都有不同程度的肿胀,若以50ml培养瓶待细胞长满瓶底的70%～80%时消化冻存,复苏时将其全部接种至2个50ml瓶中时较为合适。刚复苏的293贴壁很慢，复苏接种后24小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。复苏后48小时左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适,如果用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度。换液前宜将培养基预热。5、转染：体外应用293细胞进行细胞转染时，如果是采用磷酸钙转染，一定要注意293细胞不要全部长满细胞培养盘，长满细胞时加入磷酸钙就会使293细胞大片的脱落，最好是当293生长到1/2或2/3时进行磷酸钙转染，可以避免细胞的大量脱落。其它的经验：1、用大瓶培养较小瓶要好，可能是更有利于293均匀的分布，利于营养的摄取2、培养液要新鲜，每次只配1000ml，分为2-4瓶，不用的培养液，冻存在-20度，3、要及时传代，最好是细胞基本铺满培养瓶底部，但是细胞之间还没有完全贴紧，总是多少有空隙的时候最好。4、如果细胞贴壁不好，可能是消化过久，或是培养瓶不够干净，当然要除外细胞污染。细胞的复苏：快速取出冻存的低代次293细胞，将其安放在底端1／2浸于37℃水浴中，轻轻晃动以加速融解。在超净工作台中，以70％乙醇对细胞培养皿表面消毒，将细胞转移至75cm的细胞培养瓶中，加入10mL低代次293细胞培养基置于细胞培养箱内培养。6～8h后待细胞贴壁更换培养基。(1)利用低代次293细胞贴壁的特性，在复苏和传代时不离心，而是加入10mL培养基中和细胞消化液，培养6～8h，细胞贴壁后更换新鲜培养基，从而避免了离心剪切力对细胞造成的机械损伤；(2)在消化细胞时，振荡培养瓶，避免直接反复剧烈吹打细胞。细胞形态观察、贴壁率和生长曲线表明，这种方法对细胞损伤小，能维持细胞较好的生长状态。NG等研究表明，低代次293细胞在培养过程中传代时融合度过高或过低，其整合的腺病毒El区基因易丢失；另外，不适当的传代比率也会导致细胞生物学特性发生改变。为此，笔者把细胞传代的融合度控制在90％左右，传代比率l：以腺病毒感染质粒pFG140感染传l0代以后的低代次293细胞，o可成功包装出腺病毒，表明这种传代方法可较好保持细胞的生物学特性。