补益中药促进脐血干细胞生长分化为肝细胞的实验研究

中南大学硕士学位论文补益中药促进脐血干细胞生长分化为肝细胞的实验研究姓名：曾妍申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：唐晓鹏20070601补益中药促进脐血干细胞生长分化为肝细胞的实验研究作者：曾妍学位授予单位：中南大学相似文献(10条)1.期刊论文田晓宁.TianXiao-ning脐血干细胞的特性及其临床应用-中国组织工程研究与临床康复2009,13(36)脐血中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞,脐血采集有体内采集法和体外采集法两种方法.脐血中所有的干细胞尽可能的回收是脐血处理过程中关键的一步.脐血中单核细胞的分离也是建立脐血库和脐血干细胞移植的关键环节.脐血分离方法有密度梯度离心法、羟乙基淀粉沉降法、单克隆抗体流式细胞仪分析法、免疫磁珠分选法等,不同方法各有优劣.密度梯度离心结合直接贴壁法可在体外分离培养人脐血中的间充质干细胞.利用生物反应器可大规模扩增人脐血造血干,祖细胞.人脐血中的间充质干细胞,在一定的条件下能向肝细胞定向分化.脐血的冻存主要采用程控降温法.玻璃化法超低温保存以其简单、快速、高效等优点,在脐血干细胞的长期保存方面展现了良好应用前景.脐血造血干细胞移植具有诸多优点,广泛应用于临床各种疾病的治疗中.2.期刊论文赵林娜.李建斌.满勇.单泓.焦红亮.ZhaoLin-na.LiJian-bin.ManYong.ShanHong.JiaoHong-liang四联袋分离的脐血干细胞临床应用8例-中国组织工程研究与临床康复2009,13(32)背景:试管法分离脐血干细胞效率低,易发牛微生物污染,应用临床安伞性得不到保证,寻找一种能满足临床需要的脐血干细胞分离方法用于治疗骨股头坏死尤为迫切.目的:拟建屯一种高效、安全且具有临床应用价值的脐血干细胞分离方法.设计、时间及地点:自身前后对照实验,于2006-02/2007-08在河南省红十字血液中心血液成分应用研究所及郑州市第二人民医院外一科完成.对象:2006-02/2007-08在郑州市第二人民医院外一科住院和门诊收治的股骨头坏死患者8例,均为男性,平均年龄40.6岁,4例合并激素应用史.脐带血来自郑州市妇幼保健院正常足月分娩的健康胎儿,平均采血量90mL.分离所片j叫联袋包括1个主袋、1个空袋、2个生理盐水袋,为山东威高集团产品.方法:将采集6h内的脐血用无菌接口机与四联袋的1个空袋相连,离心分出部分血浆后,剩余的红细胞内加入羟乙基淀粉充分混匀,静止5min后加入氯化钠液等倍稀释,淋巴细胞分离液倒入四联袋的主袋内,按1:1比例将脐血缓缓加入盛有淋巴细胞分离液的主袋内,离心后白膜层流入另1个空袋内,此袋即为富单核细胞溶液.将保存24h内的脐血单个核细胞用脐血浆悬浮后,经手背浅静脉输注给股骨头坏死患者,单个核细胞≥1×108/份,2份/次,间隔3d后再次输注,共3次,此为1个疗程,共3个疗程,每个疗程间隔两三个月.主要观察指标:脐血单个核细胞回收率及细胞活性,患者临床症状改善情况.结果:分离的脐血单个核细胞收率高、效果好,且分离过程不易发生微生物污染.8例患者关节疼痛均有不同程度的缓解或消失,有效率100%;髋关节外展与内旋功能、行走距离及步态变化均有明显改善.细胞移植后6个月,5例可见不同程度的股骨头坏死区骨质密度的改变,2例股骨头形态恢复正常,另外1例无变化;12髋关节腔积液减少或消失,9髋MRl图像低信号区所占股骨头体积的百分比减少,3髋无变化.在细胞移植过程中及移植后均无并发症及发热、过敏等不良反应.结论:应用四联袋结合无菌接口技术分离脐血干细胞高效、安全,且具有临床应用价值,经静脉多次、多份输注脐血干细胞为伞身整体治疗股骨头坏死提供了一种新的手段.3.学位论文何吉人脐血干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的研究2006脐血(UmbilicalCordBlood,UCB)中含有造血干/祖细胞(HematopoieticStem/ProgenitorCells,HSCs),但与骨髓和成体外周干细胞有所不同.在过去的20年中,已经明确了脐血干细胞的存在与特性,脐血造血干/祖细胞的数量相当或超过了骨髓且大大高于成体外周血中的干细胞.与成体细胞相比,脐血造血干/祖细胞能在体外产生大量的集落,有不同生长因子存在时,能在体外培养基中长期扩增.脐血移植可治疗各种血液病,使造血重建且与常规治疗相比移植物抗宿主病(GraftVersusHostDisease,GVHD)发生率低.另外,脐血在基础研究和临床研究中存在的伦理问题较少,脐血的采集不会对新生儿造成危害,脐血干细胞可以冻存,复苏后不损伤干细胞的功能和活性,可以移植给受者.因此脐血可成为移植治疗血液病的更好的干细胞来源.目前的研究表明,无论是在体内还是体外,UCB还是移植治疗肝损伤的很好干细胞来源.在含生长因子组合的培养体系中,脐血干细胞能分化为肝细胞.在用细胞移植治疗肝损伤的模型中,人UCB细胞显示了分化为肝细胞的功能特性,在肝损伤的SCID鼠外周血中能检测到释放的人白蛋白.本实验的目的是探索肝细胞生长因子(HepatocyteGrowthFactor,HGF)、干细胞生长因子(StemCellFactor,SCF)及白血病抑制因子(LeukemiaInhibitoryFactor.LIF)体外诱导人脐血造血干细胞分化为肝细胞的可行性,为肝组织工程提供新的种子细胞来源.本研究采用密度梯度离心法和免疫磁珠分选系统,获取人脐血CD34+造血干细胞进行体外诱导分化,分为诱导组:DMEM+HGF(10ng/ml)+SCF(10ng/ml)+LIF(10ng/ml);阴性对照组:不加HGF、SCF、LIF三种因子.在培养第21天,用荧光倒置相差显微镜观察细胞形态;以逆转录聚合酶链反应(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,RT-PCR)、免疫组织化学和免疫荧光分析检测白蛋白(Albumin,ALB),人肝细胞型细胞角蛋白(Cytokeratin-18,CKl8)和甲胎蛋白(Alpha-Fetoprotein,AFP)的基因和蛋白表达;用放射免疫分析法测定第7、14、21、23、25天细胞培养上清液中人ALB的含量.结果发现在诱导组中,HSCs出现明显的细胞形态、体积和数量变化,可见细胞变圆,多呈肝细胞样细胞.RT-PCR检测:诱导组第21天出现较强的白蛋白基因表达,AFP表达较弱,与正常肝细胞相似,阴性对照组,无表达.免疫荧光和免疫细胞化学分别检测ALB、人肝细胞型CKl8:第21天ALB和人肝细胞型CKl8呈阳性;阴性对照组,均未见表达.细胞培养上清液中ALB含量在第21天达到峰值,第21天后明显下降,与阴性对照相比差异有显著性.研究表明人脐血HSCs在一定的诱导条件下具有向肝细胞分化的潜能.4.期刊论文金玮.邢怡桥.杨安怀.杨燕宁.艾明人重组表皮生长因子和牛磺酸体外诱导人脐血干细胞分化为神经元样细胞-中华眼底病杂志2009,25(4)目的探讨人重组表皮生长因子(rhEGF)和牛磺酸体外诱导人脐血间充质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的实验条件和可能机制.方法用含有105U/L青霉素、100mg/L链霉素、10%胎牛血清(FBS)、5%自体血浆、4mmol/L-谷氨酰胺、30ng/mlrhEGF的Dulbeceo改良Eagle培养基与F12以1:1混合(DMEM/F-12)培养液对人脐血MSC进行原代培养,传至第3代后改用含牛磺酸的培养基进行诱导.流式细胞仪检测细胞表面抗原CD90、CD29、CD34、CD44及CD45的表达.免疫细胞化学方法观察神经元特异性烯醇化酶(NSE)、视紫红质、巢蛋白的阳性细胞表达情况.统计学方法采用两组资料的卡方检验分析NSE、视察红质、巢蛋白的表达.结果脐血MSC首次培养5～7d,有间充质样细胞贴壁,3～4周后细胞达80%～90%融合,传代后生长加速;形态学类似骨髓源性MSC.脐血MSC均一稳定地表达MSC的相关抗原CD29、CD44、CD90,不表达CD34、CD45.经牛磺酸体外诱导后的脐血MSC中,3120个细胞中有2515个细胞表达神经元特异性烯醇化酶(NSE),3050个细胞中有903个细胞表达巢蛋白,3175个细胞中有1168个细胞表达视紫红质;未诱导组的2965个脐血MSC中仅有234个细胞表达NSE,其他抗原未见表达.两组间NSE、巢蛋白和视紫红质的表达差异具有统计学意义(χ2=3242.9,1073.0,1444.5;P值均0.01).结论人脐血MSC经rhEGF和牛磺酸诱导后能使部分MSC向神经元样细胞或视紫红质阳性细胞分化.5.期刊论文王利培.姜红.WangLP.JiangH人脐血干细胞向神经细胞定向诱导及移植治疗大鼠缺氧缺血性脑损伤-中国组织工程研究与临床康复2007,11(7)目的:综合分析人脐血干细胞向神经细胞定向诱导及移植治疗大鼠缺氧缺血性脑损伤的可行性.资料来源:应用计算机检索Pubmed2000-01/2005-12有关脐血干细胞向神经细胞定向诱导及移植治疗大鼠缺氧缺血性脑损伤的文献,检索词mesenchymalstemcells,umbilicalcordblood,transplantation,并限定文章语言种类为English.同时应用计算机检索万方数据库2002-01/2005-12有关脐血干细胞向神经细胞定向诱导及移植治疗大鼠缺氧缺血性脑损伤的文献,检索词缺氧缺血性脑病,脐血干细胞移植,间质干细胞,并限定文章语育种类为中文.资料选择:对检索到的脐血干细胞向神经细胞定向诱导及移植治疗大鼠缺氧缺血性脑损伤的相关信息进行整理,选取针对性强的文章.同一领域的文献则选择近期发表或权威杂志的文章.资料提炼:共检索到37篇相关文献,其中31篇文章符合要求,排除6篇.资料综合:很多研究证明脐血中确实存在间究质干细胞并且有很强的可塑性,而且脐血干细胞有很多优点:①脐血干细胞较原始,细胞的抗原性较弱,胞毒性T细胞祖细胞较少,故移植相关急性移植物抗宿主病的发生率低、反应轻,且脐血增殖分化能力较强,并在体内外均可稳定表达外源性目的基因.②来源广泛,干细胞数量多,易于采集、制备及保存,又不涉及社会、伦理及法律等诸多问题.因此,脐血单个核细胞可作为干细胞替代治疗中枢神经系统疾病一个新的细胞来源.结论:脐血间充质干细胞具有十分广阔的应用前景,但是对于脐血干细胞移植治疗神经系统疾病的研究尚处于探索阶段,很多研究领域都是空白,需要进一步研究,争取为神经系统疾病的治疗提供一个新的途径.6.期刊论文廖灿.刘斌.黄以宁.李焱.赵民.许遵鹏.汤雪薇.辜少玲.谢杏梅脐血干细胞库的建立及其临床应用-中华血液学杂志2001,22(8)目的建立无关供者脐血干细胞库,用于治疗骨髓衰竭、恶性及非恶性血液病、某些遗传病、重型免疫缺陷等疾病的干细胞移植.方法采集足月顺产或剖宫产的新生儿脐血,以羟乙基淀粉分离红细胞,DMSO/LMD冷冻保存.每份脐血常规检测细胞活率、有核细胞计数、祖细胞体外培养、CD34+细胞检测、HLA配型及病原学检测等.结果共采集2318份脐血,合格1240份,合格率为53.5%,合格脐血采集的平均体积(98.3±27.0)ml,分离后脐血有核细胞为(1.2±0.5)×109,回收率为(88.90±9.65)%.脐血细胞存活率为(97.00±2.61)%.CFU-GM数为(5.18±14.35)×105,BFU-E数为(10.35±11.55)×105,CFU-Mix数为(1.03±1.47)×105.脐血分离后CD34+细胞百分率为(0.5±0.32)%,细菌培养阳性4例,4例脐血CMV-IgM阳性.在广州脐血库的172例脐血移植登记患者中,HLA匹配4个位点以上的占91.12%.至2000年5月共提供9份应用于无关供者脐血移植,其中6例植入,植入成功率66.7%.结论脐血库的建立可使脐血能够较好地应用于造血干细胞移植治疗,建立脐血库有良好的应用前景.7.期刊论文张永红.曾妍.唐晓鹏.ZhangYong-hong.Zeng