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谢沐风上海市食品药品检验所xiemufeng@sina.com请大家将手机调至“振动”档！(包括闹钟、叫醒、工作安排、约会等)谢谢您的配合！液相色谱在药物分析工作中具有举足轻重地位液相色谱仪是药物分析工作者最常用的“一门武器”。本人工作16.7年，深感何时能将液相做到有“打游戏”感觉时，便是到了游刃有余、庖丁解牛的境界。现今的液相软件均已具备了强大的数据处理功能，如能运用自如，便可具有事半功倍之效。一、水相中溶质的溶解方式水相中需溶解的无机盐和表面活性剂等固体溶质，建议采用加热法，不建议采用振摇、超声等方式。因此种方式可能导致溶质处于“临界胶团浓度”，其后一旦遇到某特殊情形（如遇有机溶剂、温度剧降等）就极易析出少量结晶；而一旦析出，便会损伤仪器和色谱柱，呈现泵头处析出“盐和白粉”的现象。（引申至超声仪放置地点和洗瓶子安排）二、流动相的配制与使用1.恒度洗脱一定是将水相与有机相混合后、抽滤（使用混合型过滤膜），用一个管路（如A管）泵入仪器，这是使用的基本原则。切勿因节约有机相、便于摸索色谱条件等原因而使用两个管路（一个纯水相、一个纯有机相）泵入仪器，即便配制了脱气机。因此种情形极易造成水相中盐和表面活性剂的少量析出。★剩余流动相完全可继续使用，密封后放置阴凉处；待下次试验时与新配制的流动相混合后使用。★无需担心发霉、无机盐析出、挥发、比例不准等问题，这些皆为疑神疑鬼的表现。（引申至分析人员切忌陷入过度谨小慎微、患得患失的工作状态，要锻炼自己“不干不净、吃了没病”的魄力和勇气！）★实践是检验真理的唯一标准！实践吧~2.梯度洗脱流动相配制最为科学的方式是：A相为高比例水相-低比例有机相、B相为低比例水相-高比例有机相（英国药典几乎均如此）；其次为：A相为高比例水相-低比例有机相、B相为纯有机相；最不科学的为：A相为纯水相、B相为纯有机相，如既有质量标准采用了此种方式，建议改为第二种或第一种方式，否则基线漂移严重，难以进行稳定的杂质检测。2.梯度洗脱梯度洗脱结束后，建议经5分钟回到初始状态，再平衡5分钟后开始下一测定。这10分钟的稳定极为关键。切勿短时间内回到初始状态，会对仪器和色谱柱损伤较大。（引申至液相一定要配制自动进样装置，这样1台的工作效能可与3台手动匹配。说服领导！）三、色谱柱的安装标准操作规程（SOP）应为：取A管路放入流动相瓶中→拧松泵头→流速由0ml/min逐渐升至10ml/min，观察尾液是否呈瀑布状流出，持续10秒→拧紧泵头→流动相呈抛射状从安装色谱柱的一端喷出，观测是否呈抛物线状，持续5秒→流速逐步降至1.0ml/min→安装色谱柱，待20秒后，流动相从色谱柱另一端呈泉水状涌出再安装另一端→手握两端螺丝帽，拧紧。三、色谱柱的安装以上安装顺序遵循的是：逐级排放气泡和仪器内存留的洗液，使得安装后气泡极难混入。本人曾试验梯度洗脱连续试验一周，第一针与最后一针主成分保留时间相差在6秒以内。四、试验后色谱柱的清洗1.最为常用的C8柱、C18柱1.1流动相仅为乙腈-水或甲醇-水时继续冲洗30分钟，流速1.0ml/min，柱温保持试验时温度，即可。四、试验后色谱柱的清洗1.2水相中有无机盐、表面活性剂或三乙胺、高氯酸等物质时先采用纯水（或含有2%甲醇），冲洗A管路（试验采用哪个管路，就要从头到尾冲洗该管路），时间30分钟（如流动相中有表面活性剂，适当增加时间），流速1.0ml/min，柱温可较试验温度高出5~10℃；随后更换成20%甲醇再冲洗30分钟，流速同上，柱温箱加热装置关闭。结束后取下色谱柱放置阴凉处。四、试验后色谱柱的清洗1.2水相中有无机盐、表面活性剂或三乙胺、高氯酸等物质时很多同仁其后采用高比例的甲醇冲洗，实属画蛇添足，导致残余有机相中的水相遇到高比例甲醇后析出少量盐和表面活性剂，从而在泵头上、色谱柱中析出，也导致了色谱柱寿命大为缩短。本人曾使用过一根约2000元的色谱柱，正向用了4年、反向用了2年（反向用于检测非有关物质）。四、试验后色谱柱的清洗2.其他类型色谱柱查询获取如何科学合理地使用与清洗保存该类型色谱柱的方法，切勿盲动，否则易导致色谱柱性能急剧下降。五、试验顺序工作流程如下进行：(1)0~2小时配制流动相、对照品和供试品溶液等，切勿催促昨日试验同事。(2)2~3小时采用A管路注入流动相（B、C、D管路一般不用，除非梯度洗脱才用到B管路），平衡1小时。如流动相中有表面活性剂，建议前一晚小流速过夜，第二天上班后将流速增至1.0ml/min，平衡1小时后即可开始检测。(3)3~5小时测定空白溶剂，一定要做到基线不漂移后方可开始检测样品。所谓“不漂移”，通常系指以1.0%自身对照溶液主成分峰高约20%高度来设定的视野范围观察所得，切不可设定过小，使杂质峰显得很突兀、基线抖动得很厉害，弄得人很担心。(4)5~8小时配制完所有样品，预试了对照溶液和供试品溶液，设定好自动进样程序，程序最后一针设定为小流速过夜，紫外灯关闭。勿设定为切换至B管路洗脱，此举得不偿失。(5)9~24小时放心回家，让仪器自动进样，除非不稳定样品采取“即配即测”方式。充分利用下班后的16小时，做到从容不迫、镇定自若。(6)第二天0~0.5小时检查并计算昨晚试验结果，如发现不良记录，将流速增至1.0ml/min，平衡30分钟后，测定重新配制的该份样品即可（同时回校对照一针）。无需全部重新测定，不要过度谨小慎微。(7)第二天0.5~2.0小时如上冲洗色谱柱，交给其后试验同事。六、液相软件的使用★现今几大主流品牌的硬件性能已相差无几，主要还是软件的设计是否能使操作者得心应手、随心所欲。★建议掌握各软件的批处理、编辑样品处理模板等功能，做到一劳永逸，让软件充分为工作所用。“工欲善其事、必先利其器”。★本人曾用20分钟完成500个溶出度样品数据处理，做出溶出曲线图。体会一下~七、其他1.如需使用正相系统，强烈建议专设一台仪器（如二手的、较为破旧的、淘汰的等），切勿采用异丙醇转换，此举对仪器损伤极大，无异于“自杀”。2.正相所使用的流动相（如正己烷、环己烷等），无需抽滤，混匀超声后即可使用，“大道至简”。3.柱温箱必须配制。如欲经济，可购买国产柱温箱。只有溶出度/释放度才是☆这里所指的溶出度/释放度是指：在多pH值溶出介质中溶出曲线的测定，绝非一个介质、一个时间点、一个限度的测定。☆该测定已成为“剖析”和“肢解”口服固体制剂内在品质一种抽丝剥茧、循序渐进的重要手段；成为固体制剂内在品质呈现于外在的一种“表象”、“映射”与“载体”。“固体制剂内在品质的灵魂与核心所在”！溶出度核心理念★多条溶出曲线是——口服固体制剂的“指纹图谱”！★☻环境（用pH值表达）☻蠕动强度（虽年龄增长、减弱）人体消化道中最为关键的两个参数人体内消化道各器官的变化范围消化道各器官变化范围胃pH1.2-7.6表面张力(dyne/cm2)35-50胃液体积(ml)5-200十二指肠pH3.1-6.7收缩压(mmHg)3-30小肠pH5.2-6.0胆汁酸(mM)0-17液体流速(ml/min)0-2胃酸随年龄变化统计表（日本学者2001年发表的统计数据）02040608010203040506070年龄胃酸缺乏者的比例(%)19841989-19941995-1999从专业角度看：疗效的优劣，即药物在体内吸收的多寡，是与生物利用度密切相关的。优质药品，可在任何体内环境下（即pH值宽范围内）都有一定的崩解、溶出，即对任何人群均有较高的生物利用度。劣质药品，可能只在一种体内环境下（如胃酸正常者）才有一定的溶出和吸收，而在其他体内环境下可能崩解、溶出就会很差，生物利用度也就很低。（我国药品的问题恰在这里）02461000246中年妇女0.6A药厂产品B药厂产品05002460.20.400246Time(h)老年患者02460246年轻小伙不同制剂的溶出度试验曲线与不同患者体内生物利用度的关系——引申至转速比较溶出度试验不同患者体内生物利用度桨板法、50转桨板法、75转桨板法、100转彼此间就不相关了！100转0204060801000102030Time(min)%dissolvedAB50转0204060801000102030Time(min)%dissolvedAB0.00.51.01.52.02.502468Time(h)Concentration(ug/ml)CapsuleACapsuleB具体实例：两吲哚美辛胶囊溶出度与生物利用度的相关性不相关在身体机能虚弱者体内(1)体外药学一致（主要指多条溶出曲线一致）(2)体内生物利用度一致（即BE试验成功）(3)临床疗效一致（获得广大医生和患者的普遍认可）体外药学一致临床疗效一致体内BA一致仿制药质量评价的层次性●体内外相关性理解(Ⅰ)：体外一致→体内多数一致、BE试验成功率高！何谓“体外一致”？●如何提高BE试验成功率？不可能试验一个处方、进行一次生物等效性试验！第一层理解：均能够具有相似的溶出曲线生物等效大多数药物生物不等效体外溶出度试验，在各种溶出介质中，在严格的溶出度条件下（低转速）生物等效性试验这样就大大提高了生物等效性(BE)试验的成功率！但并不能替代BE试验。生物利用度体外多条溶出曲线处方/辅料/制剂工艺原研药生物利用度体外多条溶出曲线处方/辅料/制剂工艺仿制药相同相同不同90%企业界的使命仿制药研发的必由之路→“殊途同归”☻体外都不一致→体内多数不一致、BE试验成功率很低！《日本药品品质再评价工程》就是充分利用了该点。再评价时，由于无法再进行大量“BE试验”，故只好采用体外溶出曲线比对方法。给予仿制药厂一定时间、更改处方与工艺，使多条溶出曲线与原研制剂一致！第二层理解：pH7溶出度pH10204060801000204060..0204060801000204060Time(min)02460510152025Time(h)02460510152025胃酸正常患者预测体内血药浓度实测体内血药浓度胃酸缺乏患者不同厂家生产的甲硝唑片体外溶出度与体内血药浓度的相关性A药厂产品B药厂产品01234567010203040Time(h)01234567010203040Time(h)年轻人老年人☻体内一致、即BE试验成功→并不意味着仿制制剂临床疗效就一定与原研制剂相当。因BE试验是采用年轻男性、是人体的最佳状态、这也是BE试验的局限性所在！而原研制剂在临床阶段经过大量病例验证。越来越多的文献报道，通过BE试验的部分仿制药临床疗效与原研药依然有差距。第三层理解：只有通过对体外溶出度（释放度）的严格要求，才能尽可能地增加仿制药在年老患者、在体质虚弱患者体内生物利用度高的概率。这一观点弥补了“生物等效性试验的局限与不足”！2014年2月，媒体报道：FDA低调开展仿制药一致性评价。予以解读……对溶出度试验严格要求的意义☻体内不一致、即BE试验失败→则肯定会在体外某个溶出度条件下两者呈现显著性差异，关键就看体外溶出度研究的深度与程度了（已有愈来愈多的案例证明）第四层理解：只要体外溶出度试验比较得越充分、越多层次、多角度，多方面，就可使仿制药的内在品质无限趋近于原研药，从而实现仿制药的品质提升，做到简便易行、科学合理、便于重现、难以造假！口服固体制剂仿制药质量一致性评价技术手段——多条溶出曲线★片剂/硬胶囊：多条溶出曲线/释放曲线、崩解时限（如需要）、有关物质、含量均匀度、硬度/脆碎度。★注射用粉末：(1)表层指标：有关物质、溶液颜色、溶液澄清度、水分、pH值、无菌、热原/内毒素和不溶性微粒等。(2)深层指标：粒度分布、粒子形状、晶型、晶格能、比表面能、分散性、流变学特性等→复溶/溶解时间的不同，该指标很重要！列举各剂型关键性评价指标1.部分仿制药品的临床疗效不如原研药★某些固体制剂国产药与进口原研药相比、临床疗效相距甚远、价格也相差悬殊！★为什么不同厂家生产的同一制剂、甚至同一厂家生产的不同批号，病人服用后都会有不同疗效。具体表现为：已上市的国产仿制药中部分固体制剂对于某些患者属“安全无效”和“安全不怎么有效”范畴。《规划》