限制性核酸内切酶的命名

主要内容一．限制性核酸内切酶二．其它工具酶1．DNA连接酶2．聚合酶3．DNA修饰酶4.细胞裂解酶一．限制性核酸内切酶1.限制性核酸内切酶的定义与特点2.限制性核酸内切酶的发现3.限制和修饰作用的分子机制4.限制性内切酶的分类5.限制性内切酶的命名6.II型限制性核酸内切酶的基本识别特性7.限制性内切酶的切割方式8.II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作9.影响限制性核酸内切酶活性的因素及解决方法10.限制性内切酶的star活性11.其他特异性的限制酶12.DNA分子的片段化定义：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核苷酸酶。特点：▲存在于任何一种原核细菌中.▲在特异位点上催化双链DNA分子的断裂,产生相应限制性片段.▲各种生物呈现特征性的限制性内切酶酶切图谱.▲在生物分类,基因定位,基因重组,疾病诊断,刑事侦察领域极为重要.限制性内切酶的发现：宿主细胞的限制和修饰作用1.两种不同来源的λ-噬菌体,λK；λB.2.能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（λK→K株,λB→B株）3.当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。4.一但λK噬菌体在B株成功，由B株繁殖出λK后代，能感染B株,λK→B株.不能感染原来K株.λK×K株限制和修饰作用的分子机制1．大肠杆菌宿主细胞K株B株,有各自的限制和修饰系统。2.λ噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞K株，B株中.3．细菌利用限制和修饰系统来区分自身DNA与外DNA。4.C株不能产生限制性内切酶，其它来源λ-噬菌体可以感染C株，而在C株繁殖λ-噬菌体则在K株和B株,受到严格的限制作用。问题1.关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有（）不太恰当。A。由作用于同一DNA序列的两种酶构成B.这一系统中的核酸酶都是II类限制性内切酶C.这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰D.不同的宿主系统具有不同的限制－修饰系统2.判断下面一句话是否正确限制与修饰现象是宿主的一种保护体系，它是通过外源DNA的修饰和对自身DNA的限制实现的。1）它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR;hsdM;hsdS.2）hsdR编码限制性核酸内切酶---识别DNA分子特定位点，将双链DNA切断。（注意：DNA分子转化细胞：受体细胞去掉hsdR基因位点）3）hsdM编码产物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位点的碱基甲基化反应。4）hsdS表达产物的功能是---协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。限制和修饰作用的分子机制1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护,封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。（修饰）2)当外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解。（限制）限制和修饰作用的分子机制3)由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。4)外来少数DNA分子,虽然是外来却不被降解。但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记,一但λ-K噬菌体在B株成功，由B株繁殖出λ-K后代能感染B株,不能感染原来K株.限制性内切酶的分类：（三大类）I．I类，II类,III类.2．I类，III类为限制---修饰酶。限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能单位包含在同一酶分子中。3．II类限制性内切酶与甲基化酶是分离的，切割位点专一，适合于DNA重组。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的分类主要类型I型II型III型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATPMg2＋SAMMg2＋ATPMg2＋SAM识别序列无规律，如EcoK：旋转对称无规律，如EcoP15：AACN6GTGCCAGCAG切割位点距识别序列1kb识别序列内或附近距识别序列下游处随机性切割特异性切割24－26bp处问题：1.下面关于限制酶的叙述中哪些是正确的？（）A.限制酶是外切酶而不是内切酶B.限制酶在特异序列（识别位点）对DNA进行切割C.同一种限制酶切割DNA时留下的末端序列总是相同D.一些限制酶在识别位点内稍有不同的位置切割双链，产生黏末端E.一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链DNA,产生平末端2.II类限制性内切酶（）A.有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列B.仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供C.限制性识别非甲基化的核苷酸序列D.有外切核酸酶和甲基化酶活性E.仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供限制性核酸内切酶的命名名称属名（大写、斜体）种名（小写、斜体）株名序数来源菌株EcoRIEcoRIE.coliR株HindIIIHindIIIHaemophilusinfluenzaed株HindIIHindIIHaemophilusinfluenzaed株HpaIHpa－IHaemophilusparainfluenzae问题：下列关于限制性内切酶的表示方法中，正确的一项是（）A.Sau3AIB.E.coRIC.hindIIID.Sau3AIII型限制性核酸内切酶的基本识别特性1）大多数酶的识别顺序是严格的，少数有变动。如HindII的识别位点是GTPyPuAC.其中Py代表C或T，而Pu代表A或G。2）识别顺序的碱基数一般为4～6个碱基对，一般富含GCII型限制性核酸内切酶的基本识别特性3）大多数识别位点具有180℃旋转对称，少数酶的切割位点在识别位点外，具有旋转对称性。如EcoRI的切割位点EcoRI的识别位点5‘…GCTGAATTCGAG…3’3’…CGACTTAAGCTC…5’4）II型酶的识别顺序中的碱基被甲基化修饰后会影响部分酶的切割作用5)同一种DNA分子中，识别序列短的出现概率大，识别序列长的出现概率小。1/4n问题：1.在序列5’-CGAACATATGGAGT-3’中含有一个6bp的II类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么？2.下面几种序列中你认为哪一个（哪些）最有可能是II类酶的识别序列：GAATCG、AAATTT、GATATC、ACGGCA？为什么？3.如果DNA由5种不同的碱基组成，则一个识别4个碱基序列的限制性内切酶大概隔（）碱基对可进行一次切割A.125B.256C.425D.625E.10564.如果DNA由5种不同的碱基组成，则一个识别4碱基序列的限制内切酶大约可将1Mb的DNA切割成多少段？（）A.125B.320C.625D.1050E.1600限制性内切酶的切割方式切割位点，用或表示。A．以切出片段末端性质不同平末端5’突出的黏性末端3’突出的黏性末端限制性内切酶的切割方式B．以酶切特点来分同位酶：识别相同序列切点不同。同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。限制性核酸内切酶的切割方式EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’5‘…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’OHP5‘…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’POHEcoRI37℃退火4-7℃限制性核酸内切酶的切割方式PstI等产生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-POH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃•退火4-7℃OHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’POH限制性核酸内切酶的切割方式PvuII等产生的平头末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C…5’限制性核酸内切酶的切割方式内切酶的识别位点与切割方式之间的关系1）识别序列不同，切割方式不同如：EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTCGAG-3’3’-GAGCTC-5’2)识别顺序不同，切割产生的黏性末端相同——同尾酶如：BamHI5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BglII5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’限制性核酸内切酶的切割方式内切酶的识别位点与切割方式之间的关系3)识别序列相同，但切割方式不同——同位酶如：SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’4)相同的识别序列，切割方式也相同——同裂酶如：HpaII5’-CCGG-3’3’-GGCC-5’MspI5’-CCGG-3’3’-GGCC-5’但MspI可以切甲基化的胞嘧啶问题1.BamHI、XbaI、BglII的识别位点分别是：GGATCC、TCTAGA、AGATCT，哪些酶切结果可产生互补的末端？（）A.以上几种酶切结果产生的末端都可互补B.产生的末端都不能互补C.仅BamHI和BglII的酶切末端互补D.仅BamHI和XbaI的酶切末端互补E.仅XbaI和BglII的酶切末端互补2..BstBI(TTCGAA）消化可产生怎样的末端（）A.含5’CGAA3’序列的黏性末端B.含5’CG3’序列的黏性末端C.含5’AAGC3’序列的黏性末端D.平末端E.含5’GC3’序列的黏性末端II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作•1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1μg标准DNA所需的酶量大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：待酶切的DNA样品内切酶反应缓冲液温度37℃，1－2hr完成酶切，所需酶量由切割的DNA量决定影响限制性核酸内切酶活性的因素1）底物DNA2）内切酶的用量3）反应缓冲液(浓度（10×）mmol/L)4）反应温度底物DNA①DNA纯度蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等②DNA分子构型切割效率：线性超螺旋质粒环状病毒DNA③识别序列的侧面序列大多数限制酶对只含有识别序列的寡核苷酸没有催化活性，其序列两端各延长一个或几个核苷酸后才能被有效切割。④位点偏爱侧面序列的核苷酸组成与切割效率有关系。如pBR322DNA上的4个NaeI的识别位点切割效率不同。底物DNA⑤DNA甲基化dcm和dam甲基化酶大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基解决方法：对DNA进行有针对性的纯化；加大酶的用量，1μgDNA用10U酶；加大反应总体积；延长反应时间；2）内切酶的用量反应体系中内切酶的用量主要取决于酶本身的催化活性和底物DNA样品当底物确定后，酶的用量视酶活性而定。酶活性高的用量少，反之则高。容积活性（volumeactivity）：1ul酶液中具有的酶活性单位，即U/ul。等量的两种