高效液相色谱仪的使用仪器的组成•1泵•2进样器•3柱温箱•4检测器•5数据输出设备分离原理•溶液流动相中的各组分经过固定相时,由于与固定相发上作用(吸附、分配、离子吸附、排阻、亲和)的大小强弱不同,在固定相中的停留时间就不同,从而先后从固定相中流出。常见的检测器还有差示折光检测器(通过连续测定流通池中溶液折射率来检测试样浓度)、电导检测器(根据物质在某些介质中电离后产生电导变化来测定电离物质浓度)。光电二极管阵列检测器:紫外检测器的重要进展,全波长扫描、准确定性。仪器的使用流动相的选择•对样品有适宜溶解性(试溶解样品)•不能用纯乙腈(粘度大,容易在单向阀上形成液膜)•流动相具有一定惰性,与样品不产生化学反应•所有流动相都应该用色谱纯级,水为超纯水,并且使用前应过滤、超声脱气•流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内,不能贮存在塑料容器中峰拖尾的处理•添加10-30mMol三乙胺(triethylamine)可以抑制碱性化合物色谱峰拖尾•添加1%醋酸或10-30mMol磷酸盐可以抑制酸性化合物拖尾色谱柱的保护•一般情况下,使用前用甲醇冲柱30min,再换流动相。使用完毕后用50%甲醇冲柱30min,再用纯甲醇冲柱至柱压稳定。若流动相中有缓冲盐(乙酸、磷酸盐等)应先用纯水冲柱30-60min,然后同上。注意事项1清洗进样针的液体应该是溶解样品的溶剂2样品在进样前,必须经微孔滤膜过滤3由于甲醇的极限波长为210nm左右,故短波长测定时,最好不要采用甲醇,而用乙腈4溶解样品和标准品的溶液应相同常见问题•1柱压不稳•2保留时间不稳定•3峰型不好•4不出峰(检查流动相配比是否无误、清洗进样针)•5基线不稳解决方法•1检查是否漏液•2检查管路中是否有明显的气泡•3观察柱温是否稳定•4若无上述情况,可用水、异丙醇、甲醇、0.1mol/L的盐酸溶液高流速(5-8ml/min)冲洗管路•5经4处理后,若还不正常,可拆下单向阀依次用水、甲醇、异丙醇超声清洗准备工作1、准备所需的流动相,用合适的0.45μm滤膜过滤,超声脱气20min。2、根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱(注意方向)和定量环。3、配制样品和标准溶液(也可在平衡系统时配制),用合适的0.45μm滤膜过滤。(注意腐蚀性与有机系的的溶剂)4、检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。1、采用过滤或离心方法处理样品,确保样品中不含固体颗粒;2、用流动相或比流动相弱(若为反相柱,则极性比流动相大;若为正相柱,则极性比流动相小)的溶剂制备样品溶液,尽量用流动相制备样品液;样品数据分析物质的定性淫羊藿苷标准品淫羊藿提取液定量计算A样品C样品A标准品C标准品=公式中:A为峰面积、C为浓度常用的计算方法还有归一化法、内标法。色谱条件:流动相:甲醇-水(50:50),色谱柱:C18色谱柱,检测波长:270nm,柱温:30℃,流速:1.0mL/min。样品前处理:取药材细粉0.3g,精密加入甲醇50ml定重,加热回流1h,放冷再定重,补充损失甲醇,摇匀,经0.45μm过滤即可上机检测。标准品浓度:0.6mg/ul,供试品浓度6mg药材/ml。HPLC检测实例:丹参酮IIA含量的HPLC测定实验数据及处理(1)、以色谱峰面积为纵坐标。丹参酮标准系列溶液的浓度为横坐标,绘制标准曲线。(2)、根据试样溶液色谱图中标准品对应时间的峰面积,计算得出试样溶液中丹参酮IIA的含量。