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2016.12.05抗原抗体反应及其应用•抗原的基本知识•抗原决定簇•抗原-抗体相互作用23一、抗原的基本知识抗原(Antigen)•是指那些能够通过TCR和BCR特异性结合而激活T或B淋巴细胞、诱导正或负免疫应答的物质。•正应答导致抗体和效应T细胞的产生，而负应答则引起宿主对抗原的无反应状态，即免疫耐受。•“应”——指抗原刺激机体产生免疫应答产物即抗体或免疫效应细胞；•“答”——指相应抗原与免疫应答产物结合并将其排除体外。抗原的理化性质抗原多是分子量在4000以上的生物大分子。无机物溶解于水以后以离子的形式存在，不能与抗原识别受体形成足够数量的非共价键，故不能成为抗原。蛋白质、多糖、脂多糖和DNA等是常见的抗原。4•外源性•分子大小MW.5000-10000•化学组成与复杂性如异聚物比同聚物免疫原性更强•抗原加工和递呈的敏感性如不可溶的大分子通常是比可溶性小分子免疫原性更强（不可溶的大分子易于吞噬和加工）；不能被降解递呈的大分子物质免疫原性很低。1、抗原性与免疫原性•免疫原性(immunogenicity),指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答，诱导产生抗体或致敏淋巴细胞的特性。5AgTB致敏T细胞浆细胞抗体抗原性（特异反应性），指抗原与其诱导产生的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的特性。6AgTB致敏T细胞浆细胞抗体2、抗原的分类完全抗原（completeantigen)具有免疫原性和特异反应性的物质。半抗原又称不完全抗原(hapten，incompleteantigen)无免疫原性，只有特异反应性的物质。如青霉素，芳香族化合物、糖、核酸等。载体（carrier）赋予半抗原以免疫原性的蛋白质。半抗原+蛋白质（载体）＝完全抗原常用载体：BSA（牛血清蛋白）7完全抗原和半抗原8半抗原+载体抗体BTh完全抗原BBBTh9将半抗原与大的载体分子（通常是蛋白质）偶联在一起称为半抗原的转化作用。半抗原的转化小分子的半抗原经过重氮化以后，再与载体蛋白上酪氨酸残基偶联，形成一个共价的偶氮蛋白，表现免疫原性。超抗原（superantigen,SAg）•超抗原指一组能与某些亚型的TCR/BCR在受体外侧部位相结合的，并能直接激活T细胞或B细胞的物质。•可激活很高数量T细胞的分子，比普通抗原的激活效率高2000-50000倍。10普通抗原单克隆T细胞应答1:104-1:105超抗原多克隆T细胞应答1:4-1:10超抗原与典型抗原11区别典型抗原超抗原是否需要APC参与＋＋是否需要APC处理＋-必须与MHC类分子形成复合物+（VαJαVβDβJβ）+（Vβ）MHC限制性+-激活T细胞数1/100001/5-1/20特异性激活+-超抗原作用示意图外源性超抗原：微生物的毒素，如金黄色葡萄球菌肠毒素。内源性超抗原：次要淋巴细胞刺激抗原，如反转录病毒基因产物等。超抗原种类二、抗原决定簇1.定义抗原决定簇(antigenicdeterminant),又称表位(epitope)，是决定抗原特异性的具有一定组成和特殊结构的化学基团。它的功能是与免疫系统中淋巴细胞上的受体结合以及与相应抗体分子结合。它是免疫原引起免疫应答以及与抗体产生特异反应的基本结构单元，是免疫应答特异性的物质基础。122.类型（1）顺序决定簇(sequentialdeterminant)，又称线性决定簇(lineardeterminant)，序列相连续的氨基酸片段构成的决定簇。（2）构象决定簇(conformationaldeterminant)，又称非线性决定簇(non-lineardeterminant)，由不相连接的氨基酸顺序片段经多肽折叠卷曲而组合起来的功能基团，一般位于蛋白质的表面。1314结构决定簇与顺序决定簇15两种抗体与一个连续性抗原表位及一个非连续性抗原表位的相互作用蛋白质结构与抗原表位163.蛋白质的结构与抗原决定簇的关系（1）蛋白质的一级结构只有顺序决定簇；（2）蛋白质的二级结构与抗原的反应性密切有关；（3）蛋白质的三级结构与抗原构象决定簇密切相关；（4）蛋白质四级结构与抗原构象决定簇和免疫原价数密切相关；B细胞抗原表位的特性•天然蛋白的B细胞抗原表位通常由蛋白表面的亲水氨基酸组成，易于接近膜结合或自由的抗体。•顺序抗原表位(SequentialEpitopes),连续抗原表位(ContinuousEpitopes),蛋白质一级结构•结构抗原表位(ContinuousEpitopes),不连续抗原表位(DiscontinuousEpitopes)，蛋白质三级结构。1718TCR识别靶细胞表面MHC/抗原肽复合物T淋巴细胞与MHC分子与BCR不同，TCR不能与游离的抗原结合，而只能识别被主要组织相容性（MHC）分子递呈的短肽，因此T细胞对抗原的识别和应答具有MHC限制性。MHC分子是一类独特的跨膜糖蛋白大分子，由α和β链非共价结合而成。表达于细胞表面的MHC分子必须与9-17个氨基酸的短肽相结合。特性T细胞表位B细胞表位表位分子TCRBCRMHC分子必需无需表位性质主要是线性多肽天然的多肽、多糖、脂多糖、有机化合物表位大小8-12氨基酸(CD8-TC)12-17氨基酸(CD4-TC)5-15个氨基酸，5-7个单糖或5-7个核苷酸表位类型线性表位构象、线性表位表位位置抗原分子任意部位抗原分子表面19按照与抗原受体细胞结合不同，分为B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。4.抗原-抗体反应的特异性抗原表位的性质、数目、位置、空间排列和立体构象决定着抗原-抗体反应的高度特异性。205.共同抗原表位与交叉反应1.共同表位（commonepitope）：指不同抗原之间含有的相同或相似的抗原表位。2.交叉反应（cross-reaction）：指抗体或致敏淋巴细胞对具有相同或相似表位的不同抗原均具有的反应（交叉结合）。21三、抗原-抗体相互作用•抗原抗体反应的原理•影响抗原抗体反应的因素•抗原抗体反应的应用放免测定、Elisa、WesternBlot······2223抗原抗体反应:指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。抗原抗体反应的原理体内：体液免疫应答的效应作用体外：各种免疫学检测技术包括241、抗原抗体的亲和力和亲合力亲和力（affinity）：是抗体分子上一个抗原结合点与一个相应的抗原决定簇之间的相适应而结合的强度，是抗原与抗体间固有的结合力。是指一个抗原决定簇和抗体分子上的一个Ab结合位点之间的反应强度。亲和力=吸引力+排斥力25亲和常数（K）：K值越大⇨抗体的亲和力越高⇨与抗原结合越牢固抗体与抗原结合是可逆的反应，在平衡时其亲合力（avidity）：是指一个抗体分子与整个抗原表位之间结合的强度，与抗体结合价直接相关。另外也与亲和力强弱有关。26抗原与抗体之间的总作用强度与很多因素有关，包括抗原价数2、抗原抗体之间的相互作用力：氢键离子键疏水作用力范德华力27•不形成牢固的共价键，通过非共价键结合•这种弱的结合力涉及几种分子间的作用力1、离子键•概念：抗原和抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互的引力。28离子键强度的大小与两个相互作用基团间的距离的平方成反比。2、范德华引力•概念：抗原和抗体相互接近时，各自所携带的原子与原子、分子与分子由于分子极化作用而出现的引力。29•结合力的大小与两个相互作用基团的极化程度的乘积成正比、与它们之间距离的7次方成反比。•作用力最小•作用大小取决于二者分子空间构型的互补性3、氢键结合力•概念：供氢体上的氢原子与受氢体原子间的引力。30•供氢体：－COOH、－NH2和－OH•受氢体：氧、氮氢键结合力与供氢体和受氢体之间距离的6次方成反比。最具特异性（必须供氢体和受氢体互补才能实现氢键的结合）4、疏水作用力（疏水键）概念：两个疏水基团在水溶液中相互接触时，由于对水分子排斥而趋向聚集的力。31•抗原决定簇与抗体上的结合点靠近，互相间正、负极性消失，亲水层立即失去。•结合力最强，约占总结合力的50％。2、抗原抗体反应的特点特异性比例性可逆性阶段性3233一、特异性（specificity）1、概念：一种抗原分子通常只能与其刺激机体后产生的抗体结合，这种抗原与抗体结合反应的专一性称为特异性。特异性示意图342、决定因素：由抗原决定簇和抗体分子超变区之间空间结构的互补性决定的。3、应用：由于抗原抗体反应具有高度特异性，故可用已知的抗原（抗体）来检测相应未知的抗体（或抗原）。35概念：两种不同的抗原分子具有部分相同或类似结构的抗原表位，可与彼此相应的抗血清发生反应。4、交叉反应（crossreactions）抗原抗体交叉反应示意图AgB36二、可逆性（reversibility)1、概念：是指抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下可解离为游离抗原与抗体的特性称为抗原抗体结合的可逆性。2、原因：抗原抗体的结合是分子表面的非共价键结合，因此形成的复合物不牢固。3、抗原抗体反应动态平衡式如下：374、决定抗原抗体解离的因素（1）抗体与相应抗原的亲合力。亲合力低的抗体与抗原形成的复合物较易解离。（2）环境因素对复合物的影响。PH过高或过低、增加离子强度均可破坏静电引力，使抗原抗体结合力下降，促使其解离。注意：解离后的抗原或抗体仍然保持其原有生物活性38三、比例性（proportionality）1、比例性是指抗原与抗体发生可见反应遵循一定的量比关系。2、以絮状沉淀实验为例，受抗原抗体比例性的影响非常明显。3、根据所形成的沉淀物及抗原抗体比例关系绘制反应曲线。39出现沉淀量最多的管为最是比例管。各管抗原倍比稀释加入抗血清各管抗体量不变振摇摇匀、37℃孵育沉淀量不同抗体与多价抗原结合的浓度带现象多价抗原：一个大分子抗原有多个抗原决定簇而成为多价抗原。单价抗原：一个抗原决定簇的抗原。抗体与单价抗原形成的复合物是可溶性的抗体与多价抗原形成的复合物大多数能形成沉淀。沉淀反应可用于研究抗体与大分子抗原结合的特性。4041沉淀的抗体量抗原量抗原抗体反应与沉淀形成沉淀反应曲线测定方法：在一定量的抗体中，逐渐增加抗原浓度，沉淀的形成与抗体的比例密切相关。曲线分3个区：抗体过量区（前带现象）：小分子复合物，不形成沉淀，。抗原抗体等带区：大量沉淀，无游离的抗原或抗体。抗原过量区（后代现象）：沉淀少。4243四、阶段性第一阶段：抗原与抗体发生特异性结合阶段特点：反应快第二阶段：反应可见阶段特点：反应时间较长44抗原抗体反应影响因素影响抗原抗体反应的因素很多，主要有两个方面：一是抗原抗体本身的因素；另一方面是反应环境因素。一、反应物自身因素抗原抗体反应中，抗原和抗体是反应的主体，所以它们的特性直接影响其结合情况。(一)抗原抗原的理化性状、表面抗原决定簇的种类和数目等均可影响抗原抗体反应的结果。45(二)抗体抗体对抗原抗体反应的影响主要有以下三个方面：(1)来源：不同动物来源的免疫血清，其反应性存在差异。如家兔等大多数动物的免疫血清，由于具有较宽的等价带，与相应抗原结合易出现可见的抗原抗体复合物。马、人的免疫血清等价带窄，抗原不足或过剩，均易形成可溶性复合物。而单克隆抗体一般不用于沉淀或凝集反应。(2)浓度：抗体的浓度是相对于抗原而言的，二者浓度合适时才易出现可见的反应结果，所以在试验前应先进行预试验，滴定抗原抗体最佳反应浓度。(3)特异性与亲合力：特异性与亲合力是影响抗原抗体反应的关键因素，它们共同影响试验结果的准确度。试验试剂应尽可能选择高特异性、高亲合力的抗体，以保证试验的可靠性。46二、环境条件(一)电解质抗原与抗体发生结合后，由亲水胶体变为疏水胶体的过程中须有电解质参与才能进一步使抗原抗体复合物表面失去电荷，水化层破坏，复合物相互靠拢聚集，形成大块的凝集或沉淀。若无电解质参加，则不出现可见反应。为了促使沉淀物或凝集物的形成，常用O.85％氯化钠或各种缓冲液作抗原及抗体的稀释液及反应液。但电解质的浓度不宜过高，否则会出现盐析现象。(二)酸碱度蛋白质具有两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应必须在合