18_免疫学检测技术及其应用

第十八章免疫学检测技术及其应用首都医科大学免疫学系第一节抗原或抗体的体外检测抗原-抗体反应：antigen-antibodyreaction。是指抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合的反应。血清学反应：serologicalreaction。指体外的抗原-抗体反应。一、抗原-抗体反应特点特异性：亲和力、亲合力、交叉反应可逆性可见性阶段性二、抗原-抗体反应影响因素电解质酸碱度温度三、抗原-抗体反应类型和检测方法中和反应凝集反应沉淀反应补体参加的反应免疫标记技术酶免疫测定法免疫荧光法放射免疫测定法（一）凝集反应（agglutination）1.直接凝集反应：颗粒性抗原+相应抗体→凝集玻片法：细菌及ABO血型鉴定试管法：肥达氏反应抗原吸附于载体+相应抗体→凝集常用载体：乳胶颗粒、羊红细胞2.间接凝集反应3.间接凝集抑制试验将可溶性抗原与相应抗体预先作用，再加入相应的致敏颗粒。妊娠诊断试验：检测尿中的HCG4.抗人球蛋白试验（Coombs试验）用途：检测单价抗体直接Coombs试验：检测结合在Rh+红细胞上的单价抗体；间接Coombs试验：检测游离的Rh单价抗体。（二）沉淀反应(precipitation)可溶性抗原+相应抗体→沉淀–单向琼脂扩散试验：测Ig、补体含量。–双向琼脂扩散试验：–火箭电泳：Ag置“－”极–对流免疫电泳：Ag置“－”极，Ab置“＋”极–免疫电泳：–免疫比浊法：环状沉淀絮状沉淀1.单向琼脂扩散试验2.双向琼脂扩散试验3.对流免疫电泳原理：将双扩与电泳技术结合在一起，测定可溶性抗原。阴极阳极（-）（+）电泳电渗AgAb4.火箭电泳将单向免疫扩散与电泳技术结合，可快速测定标本中可溶性抗原的含量。5.免疫电泳先电泳分离标本中抗原成分，再沿电泳方向挖抗体槽，加抗体，进行双扩。用于血清蛋白及抗体成分的分析及抗原/抗体提取物纯化鉴定。6.免疫比浊法该技术是利用抗原－抗体复合物在液相中形成浊度来测量抗原含量的方法。方法：透射光比浊法散射光比浊法免疫乳胶比浊法速率抑制免疫比浊法（三）补体参加的反应此类反应是利用抗体与红细胞表面相应抗原结合后，使反应体系中补体激活导致红细胞破坏，出现溶血现象建立的。补体结合实验：待测抗原＋待测抗体（待测的反应系统）补体抗体＋红细胞（指示系统）溶血空斑试验HLA血清学分型法：即补体依赖的微量细胞毒实验（四）免疫标记技术抗原抗体反应与标记技术结合，定位、定量、定性测定。标记物：荧光素、酶、放射性核素、化学发光物质、胶体金等。类型：免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标记技术等。1.酶免疫测定法是用酶标记Ab进行的抗原抗体反应。常用的酶：辣根过氧化酶、碱性磷酸酶常用底物：邻苯二胺（OPD）常用方法：酶联免疫吸附试验(ELISA)免疫组化法（1）酶联免疫吸附试验（ELISA）夹心法（测抗原）间接法（测抗体）ELISA(双抗体夹心法-测Ag)（2）酶联免疫斑点试验（ELISPOT）用于效应细胞分泌单一细胞因子的测定。（3）BAS-ELISA生物素-亲和素系统（BAS）是一生物放大系统，利用亲和素-生物素-酶的连接关系，追踪生物素标记的抗原或抗体，通过酶催化底物显色，检测相应的抗体或抗原，灵敏度高。（4）免疫组化技术ImmunohistochemistyTechnique是用标记的已知抗体与组织或细胞表面相应抗原结合发生反应，对抗原进行定位、定性或定量检测的技术。2.免疫荧光法(异硫氰酸荧光素、藻红蛋白)直接法：用已知荧光标记的抗体检测未知抗原。间接法：用荧光标记的抗抗体，检测未知的抗原/抗体。补体法：3.放射免疫测定（RIA）将放射性核素分析的高度灵敏性与抗原抗体反应的特异性结合起来的技术，测定激素和药物。常用I125和I131快速，敏感（pg)，但污染环境，有一定的危害性。4.免疫胶体金技术（ICS）Immunologicalcolloidalgoldsignature是用胶体金颗粒标记抗体或抗原，用以检测未知抗原或抗体的技术，可用于多种液相免疫测定和固相免疫分析。免疫层析法：immunochromatography免疫层析法操作和原理①首先将已知特异性抗体固定于硝酸纤维素膜上某一区带；②测试时将上述硝酸纤维素膜一端浸入待检样品中（尿液或血清），通过毛细管作用样品将沿膜向前移动；③当样品进入特异性抗体固定区带时，若样品中含有相应抗原即可与该区带抗体特异性结合，进而通过免疫胶体金所呈现的紫红色条带判定试验结果。早孕诊断（硝酸纤维素膜诊断试纸制备）①首先将胶体金致敏抗体—胶体金标记的鼠抗人绒毛膜促性腺激素（HCG）特异性抗体，松弛附着在玻璃纤维上，再将上述玻璃纤维固定在硝酸纤维素膜G处；②将鼠抗人HCG特异性抗体固定在硝酸纤维素膜T处；③将兔抗鼠IgG抗体（二抗）固定在硝酸纤维素膜C处；④硝酸纤维素膜最下方A处（附吸水纸）是滴加待检或接触尿液部位，在硝酸纤维素膜最上方B处有吸水纸，有助于形成毛细管层析作用。早孕诊断（原理）将待检尿液滴加在检测试纸A区，或将检测试纸A区插入待检尿液中，通过层析作用待检尿液向B区移动，流经G区时将胶体金标记HCG抗体从玻璃纤维上复溶，若待检尿液中含有HCG，即形成胶体金标记抗体-HCG复合物；上述复合物迁移至T区时，可被固相HCG抗体识别结合，形成固相HCG抗体-HCG-胶体金标记抗体复合物，胶体金聚集呈现阳性紫红色检测线；剩余胶体金标记抗体迁移到C区与兔抗鼠IgG抗体（二抗）结合，胶体金聚集呈现紫红色质控线。胶体金免疫层析双抗夹心法试验原理示意图早孕诊断（结果分析）①测试纸条出现两条紫红色反应线：为早孕阳性；②测试纸条检测线颜色弱于质控线：为早孕弱阳性；③测试纸条仅在质控线呈现紫红色条带：为早孕阴性；④测试纸条质控线处无紫色条带出现：为试验无效。5.化学发光免疫分析（CLIA）Chemiluminescenceimmunoassay标记物：鲁米诺等。是将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。6.免疫印迹法（Westernblotting)先将抗原经SDS-PAGE电泳分开，再将分开的蛋白质转印到醋酸纤维膜上，然后放入含有抗体的溶液中，洗去未结合抗体，再加标记的二抗，通过显色或发光显示结果。第二节免疫细胞及其功能检测葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法:BeforecentrifugeAftercentrifugeFig.1Fig.2一、外周血单个核细胞的分离二、淋巴细胞及其亚群的分离1.玻璃粘附法2.尼龙毛分离法3.E花结分离法T细胞羊红细胞4.免疫吸附分离法（洗淘法）（immunemagneticbead,IMB）将已知抗细胞表面标记的抗体交联在磁性微珠上，与细胞悬液作用后置于磁场中，借磁力的作用将磁珠结合的细胞分开。5.免疫磁珠分离法6.流式细胞术（flowcytometry）分离法细胞用荧光素标记的抗体染色，通过流式细胞仪检测。检测T细胞总数:抗CD3检测CD4+/CD8+T细胞:抗CD4/CD8检测B细胞:抗SmIg三、淋巴细胞功能测定（一）T细胞功能测定：1.T细胞增殖试验：淋巴细胞转化试验观察在有丝分裂原（PHA、ConA）或特异性抗原刺激下T细胞的增殖反应，测定细胞免疫功能。用3H-TdR法、MTT法测T细胞增殖。2.迟发型超敏反应皮肤试验：例如OT试验（二）B细胞功能测定1.血清免疫球蛋白含量测定2.抗体形成细胞测定试验3.酶联免疫斑点试验（ELISPOT）抗体形成细胞测定试验溶血空斑形成细胞试验（三）细胞毒试验Tc和NK对其靶细胞有直接的细胞毒作用。方法：51Cr(铬)释放法乳酸脱氢酶释放法凋亡细胞检测法四、吞噬细胞功能测定中性粒细胞趋化功能的测定中性粒细胞吞噬功能的测定巨噬细胞吞噬功能的测定巨噬细胞吞噬鸡红细胞掌握常见的凝集反应、沉淀反应及其用途。ELISA夹心法和间接法的步骤溶血空斑试验的方法和用途。