地贫筛查中的血红蛋白电泳

地贫筛查中的血红蛋白电泳操作技术解放军第三0三医院血液实验室王荣新血红蛋白的组成血红蛋白由血红素与珠蛋白组成血红素：铁原子与原卟啉Ⅸ复合物。珠蛋白：包括α、β、γ、δ、ε和ζ珠蛋白6种。血红蛋是由两种不同的鳌合了血红素的珠蛋白肽链所形成的四聚体结构，在人体的不同发育时期，其主要的血红蛋白（Hb）组成不同。人体发育过程中Hｂ的组成发育期血红蛋白肽链组成胚胎期Gower1ζ2ε2Gower2α2ε2胎儿期Porlandζ2γ2Fα2γ2Aα2β20－2周岁左右Fα2γ2Aα2β2A2α2δ22周岁后以后Aα2β2A2α2δ2Fα2γ2Hb的种类A.正常的Hb分三类a.HbA(α2β2)b.HbF(α2γ2)c.HA2(α2δ2)B.异常Hb有两类a.快速异常Hb:稳定Hbb.慢速异常Hb:不稳定Hb基层常用的电泳分析方法醋酸纤维膜电泳琼脂凝胶电泳醋酸纤维膜电泳→主要过程←琼脂凝胶电泳↓RBC洗涤↓制备溶血↓点样↓电泳↓染色与脱色↙↘扫描法↙比色法:分区剪下色带，洗脱分区切割色带,融化琼脂，干燥,透明→比色血红蛋白电泳设备醋酸纤维膜电泳▊▋▋▉▋▋▋HJKAGDE点样线→正常→▉▍▋▋AFA2CAHbA2的常用测定方法原理:根据不同Hb自带电荷的不同、分子量大小的不同、结构和等电点的不同,在一定pH值的缓冲液中朝特定方向泳动，在一定的电压下经一定时间，可分离出各自的区带。主要类别:醋酸纤维素膜电泳法琼脂凝胶电泳法HbA2含量测定:洗脱法扫描法血红蛋白A2测定不连续电泳将HbA2分离后，分别剪出膜条中的HbA和HbA2区带，分别放入试管中，HbA加蒸馏水20ml，HbA2加4ml，浸泡30分钟，不定时摇动，使Hb完全冼脱下来后混匀，用721分光光度计以波长413nm蒸馏水校正零点，读取光密度OD值并计算出结果。抗碱血红蛋白(HbF)测定设备：721分光光度计，刻度吸管，秒表，玻璃漏斗，滤纸。试剂：1/12mol/LKOH或NaOH溶液，酸性半饱和硫酸铵溶液。方法：取两支试管，测定管加入溶血液0.1ml，对照管加入0.02ml，于测定管中加入KOH1.6ml，摇匀，1分钟时立即加入酸性半饱和硫酸铵溶液3.4ml，倒转6次，放10分钟，滤取溶液检测，用波长540nm蒸馏水校正零点，分别读取测定管和对照管光密度OD值，计算出结果。HbCS的区带多在HbA2位置的前后，含量低，2％左右，很不稳定，有时还可分开成三或四小区带，用联苯胺染色可确定。HbE为慢速异常区带，其位置相当于HbA2。HbH和HbBart’s为快速异常区带。全自动Hb电泳仪目前国内使用的主要有美国的Helena电泳仪、扫描仪和分析系统。法国的Sebia电泳仪、扫描仪和分析系统。国产的金桑特电泳仪、扫描仪和分析系统。1.通过扫描定量给出HbA、HbA2和HbF值。2.异常区带通过查表确定。HbE区带的鉴别A.联苯胺染色,鉴定是否为HbB.区带位于HbA2区带位置上,在阴性(-)泳动速度最慢的一种异常Hb,难与A2区分开C.HbA2定量在10%以上,应考虑为HbED.HbE纯合子只有HbF和HbE,HbE高达95%以上HbH区带的鉴定A.联苯胺染色,确定是否为HbB.在阳极(+)泳动速度最大的Hb区带C.HbH包含体阳性(+)D.pH6.5缓冲液(酸性)唯一向阳性(+)移动的Hb区带E.Hb↓MCV↓MCH↓F.HbBart’s区带在HbH区带后,泳动速度比HbH稍慢些,有Bart’s区带,一般都有H区带,H含量高达30%多,但不会超出40%,低少到1%左右。HbA2在血红蛋白病中的意义HbA2组成:α2δ2HbA2参考值:1.2%-3.5%HbA2含量的改变:HbA2水平升高,是β地贫基因携带者的特征性标志,故HbA2定量的准确与否,对于临床一线β地贫基因携带者的筛查至关重要。血红蛋白（Hb）病1.血红蛋白病：基因突变导致合成的珠蛋白肽链结构异常（如：镰状细胞血红蛋白病/HbS）2.地中海贫血：基因突变导致一种或多种珠蛋白肽链合成减少或缺如（α/β地贫）3.获得性血红蛋白病：接触或误服化学药物Hb病为世界上发病率最高危害最大的单基因遗传病，被WHO列为严重危害人类健康六大疾病之一。全球约有4.83%的人口携带Hb病基因,每年各类重型地贫(包括地贫复合异常Hb病类型)患儿的出生率不低于2.4‰。据此推算,全球每年至少约35万Hb病患儿出生;至今为止，全球在分子水平上已鉴定出近1000种不同的珠蛋白突变基因，其中包括700多种异常Hb变异体和200余种β地贫基因以及70多种α地贫突变,其中中国人群中异常Hb、β地贫基因和α地贫突变各占70多种、34种和11种。临床常见的异常血红蛋白以速度快慢排序1.血红蛋白E/A22.血红蛋白D/S3.血红蛋白G4.血红蛋白K5.血红蛋白J6.血红蛋白HHb电泳操作中的经验与教训1.RBC洗涤：离心的速度和时间要够，生理盐水与血比例要5：1，血浆与冼涤生理盐水要尽量吸干净。2.制备溶血：加入的溜水、溶血剂与红细胞体积要符合要求。离心的速度和时间要够。3.点样:血红蛋白液适量，不能太宽。4.电泳:醋纤膜浸泡时间要够长，平衡时间要够。5.染色与脱色:时间要够。1.正常新生儿9.轻型β地中海贫血2.胎儿水肿综合征10.异常HbD杂合子3.α地中海贫血1(脐血)11.异常HbG杂合子4.HbCS-HbH病型12.轻型β地中海贫血复合HbE5.重型β地中海贫血复合HbE13.正常成人6.轻型β地中海贫血14.正常成人7.异常HbK杂合子15.HbH病8.异常HbJ杂合子谢谢！地贫防治网站：联系电话：2870295（地贫检验）2870135（地贫输血）2870640（遗传咨询）2870640（药物邮购）