3、ELISA

ELISA酶联免疫吸附何伟2014/10/10目录1234ELISA原理ELISA简介ELISA实验步骤ELISA相关仪器、试剂定义酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay）,简称ELISA，它是实验室最常用的蛋白质检测方法。是用酶来标记抗原和抗体的分析技术。由于酶的高效生物催化作用，已给酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来及其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可以被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法（Enzyme-Linkedz1Assay，ELISA）特点特异性：ELISA是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而，具有特异性。敏感性：由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结合物，它可以催化底物分子发生反应，产生放大作用，使本法具有很高的敏感性。ELISA简介酶是能够催化化学反应的特殊蛋白质1.抗体：指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。2.抗原：抗原，是能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应3.二抗：第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号抗原、抗体、二抗概念球是抗原倒Y是抗体先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。ELISA可用于测定抗体，也可用于检测抗原。ELISA基本原理球是抗原倒Y是抗体检测抗体的间接法检测未知抗体双抗原/抗体夹心法检测未知抗原竞争法检测小分子抗原的其它方法如直接法、捕获包被法、竞争法（测抗体）、双抗原夹心法、ABS-ELISA法等其他方法。ELISA类别检测抗体的间接法检测未知抗体间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。ELISA类别双抗原/抗体夹心法检测未知抗原ELISA类别双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，先将已知抗体连接在固相载体上，待测抗原与抗体结合后再与酶标二抗结合，形成抗体-待测抗原-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体原成正比。竞争法检测小分子抗原ELISA类别当小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的抗体结合位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。第一：实验设计1.了解将要测定的样品属于什么类别，选用最佳的ELISA检测方法；2.选用正确的阴性对照品、阳性对照品、样品标准品等；3.规划实验中所使用各种试剂的浓度、加入量、反应时间等；4.再细化实验中每个步骤的开展时间，合理的时间安排能使实验有条不紊进行。第二：实验准备1.实验所使用物料的清点；2.实验试剂的配备；3.实验仪器的预约；ELISA主要步骤ELISA基本步骤抗体包被洗板多余抗体封闭洗板加待检体、抗原-抗体结合洗板，加入二抗，与一抗结合洗板呈色，酶标仪读数目的抗原非特异抗原抗体-1显色酶抗体-2•抗体-1包被在孔底•加入含目的抗原的样品•抗原和抗体-1特异结合•洗板除去非特异性结合的抗原•抗原和抗体-2特异结合•显色反应，微孔板检测信号1.包被（在聚苯乙烯板上包被特异性已知抗体，使之与板结合）4℃过夜（大于12小时）或37℃孵育2小时，包被后洗涤一次；2.封闭（一般使用0.1~2%BSA，5%脱脂奶粉，1%明胶，10%小牛血清等）37℃反应2小时（封闭液体积要大于包被液体积），封闭后清洗3次；3.加入含有待测抗原的样品，37℃孵育1小时；4.洗涤，清洗3次；5.加入酶标液（酶标二抗），37℃孵育1小时；6.洗涤，清洗5次；7.加入酶促反应底物，发生显色反应（37℃避光显色5~15min)，终止显色后测量450/630nm吸光值。注：上面实验共12次清洗，清洗次数可适当增多，同一反应尽量保证使用同一种清洗液常见清洗液有PBST、TBST、PBS等。均可用洗板机节约时间提高工作效率及操作规范性三、ELISA实验操作实际操作视频定性测定定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。待测孔（P）与对照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者为阳性，N为阴性对照孔。定量测定通过标准品浓度及吸光度绘制标准曲线，进行定量分析四：结果判定常用试剂：1.包被缓冲液：0.05MPH9.6碳酸盐缓冲液、0.1MPH9.6碳酸盐缓冲液、pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液等。2.封闭液：0.1~2%BSA，5%脱脂奶粉，1%明胶，10%小牛血清等（一般溶于0.15MPBS中）。3.洗涤液：PBS、PBST、TBST等。4.抗体稀释液：PBST、0.5~2%BSA（溶于PBST中）等。5.底物缓冲液：TMB显色液、OPD显色液、ABTS显色液、AP显色液等，根据所使用的酶标抗体选用对应的底物缓冲液显色。6.终止液：2M硫酸。实验中使用的试剂、仪器仪器注意事项1.正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。2.固相载体的选择：有聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。3、包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。注意事项4、酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。5、酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。ELISA的应用ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面：1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。2、研究抗酶抗体的合成。3、显现微量的免疫沉淀反应。4、定量检测体液中抗原或抗体成份。ELISA应用领域细胞因子系列肝纤维化系列肿瘤标志物系列内分泌系列传染病系列心血管系列糖尿病系列骨代谢系列凝血因子和血凝系列优生优育系列农口检测系列………..细胞因子及肝纤维化检测试剂盒白介素-16hIL-16干扰素-αhIFN-α肿瘤坏死因子-αhTNF-α表皮生长因子hEGF血管内皮生长因子hVEGF粒细胞集落刺激因子hG-CSF白血病抑制因子hLIF血小板衍生生长因子hPDGF肝生素hHGF干细胞因子hSCF血小板生成素hTPO红细胞生成素hEPO肿瘤生长相关因子hGRO神经生长因子hNGF细胞凋亡因子hsFas/APO-1金属基质蛋白酶-1hMMP-1Ⅲ型胶原（CollagenTypeⅢ）Ⅲ型前胶原（PCⅢ）Ⅲ型前胶原肽（PⅢNP）Ⅱ型胶原（CollagenTypeⅡ）尿液Ⅳ型胶原（CollagenTypeⅣ）Ⅰ型前胶原羧基端肽（PICP）Ⅰ型胶原胶原N端前肽（PICP）基质金属蛋白酶-1（MMP-1）基质金属蛋白酶-2（MMP-2）基质金属蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）透明质酸（HA）大鼠Ⅳ型胶原(ranCollagenTypeⅣ)大鼠基质金属蛋白酶-1（ratMMP-1）肿瘤及内分泌系列酶免试剂盒卵巢癌抗原(CA125)游离前列腺特异性抗原(f-PSA)胃肠癌抗原(CA19-9)神经特异性烯醇化酶(NSE)胰腺癌抗原(CA242)前列腺特异性抗原(PSA)乳腺癌抗原(CA15-3)游离β人绒毛膜促性腺激素癌胚抗原(CEA)铁蛋白(Ferritin)甲胎蛋白(AFP)三碘甲状腺原氨酸(T3)游离甲状腺素(FT4)人绒毛膜促性腺激素(HCG)促甲状腺素(TSH)促黄体生成激素(LH)游离雌三醇(F-E3)催乳素(PRL)人生长激素(HGH)17-羟-孕酮(17-OHP)雌二醇(E2)促卵泡(FSH)胎盘生成素(HPL)雌三醇(E3)孕酮(PROG)游离睾酮(F-TESTO)传染病及优生优育系列酶免试剂盒团菌IgG/IgM/IgAEB病毒早期抗原IgG抗体沙眼衣原体(CTIgG/IgM/IgA)人类T淋巴细胞白血病病毒抗体肺炎支原体(MPIgG/IgM/IgA)梅毒螺旋体(TPIgG/IgM)流行性腮腺炎病毒IgG抗体带状疱疹病毒IgG麻疹IgG/IgM抗体(MeaslesIgG/IgM)腺病毒IgM(ADVIgM)丙肝抗体(HCV)结核菌抗体IgG(TBIgG)艾柯病毒IgM(ECHOIgM)登革热IgG/IgM乳头瘤病毒抗体(HPV-Ab）EB病毒抗原(EB-Ag)巨细胞病毒抗体IgG(CMVIgG)弓形体抗原(ToxAntigen)抗精子抗体总Ig(ASAb)风疹病毒抗体IgG(RubellaIgM)单纯疱疹1病毒抗体IgG/IgM(HSV-1IgG/IgM)抗精子抗体IgG(ASAbIgG)弓形体抗体IgG/IgM(ToxIgG/IgM)单纯疱疹2病毒抗体IgG/IgM(HSV-2IgG/IgM)抗子宫内膜抗体(AEA)抗HCG体(HCG-Ab)单纯疱疹1,2病毒抗体IgG/IgM(HSV1/2IgG/IgM)抗卵巢抗体(AOAb)抗透明带抗体(aZP)抗子宫内膜抗体IgG(AEAIgG)抗卵巢抗体(AOAb)（IgA/IgM/IgG）新生儿TSH(neo-TSH)糖尿病及骨代谢系列瘦素受体(LeptinReceptor)小鼠胰岛素（MouseInsulin）生长激素GH超敏生长激素GH7000胰岛素C肽（C-PeptideofInsulin）胰岛素原（Proinsulin）猪胰岛素（PorcineInsulin）羊胰岛素（SheepInsulin）牛胰岛素（BovineInsulin）瘦素（Leptin）小鼠/大鼠瘦素（Mouse/RatLeptin）瘦素Leptin（临床范围）促肾上腺皮质激素（ACTH）皮质酮（Corticosterone）大鼠皮质酮（RatCorticosterone）HLA-B大鼠骨钙素小鼠骨钙素破骨细胞抑制因子人可溶性破骨细胞异化因子鼠可溶性破骨细胞异化因子维生素D受体骨涎蛋白BSP脱氧吡啶啉人抗酒石酸酸性磷酸酶大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶骨钙素大鼠降钙素鲑鱼降钙素骨I型胶原N末端肽（血）胶原交联（尿）胶原交联（血）农产品食品及医药卫生安全系列呋喃西林代谢物（SEM）检测试剂盒氟苯尼考（FF）ELISA快速检测试剂盒猪口蹄疫ELISA诊断试剂盒猪日本乙型脑炎诊断ELISA试剂盒猪圆环病毒2型感染诊断与监测ELISA