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氨基酸营养缺陷性的筛选与鉴定————芽孢杆菌实验流程图1一：认识芽孢杆菌芽孢杆菌（Bacillaceae），细菌的一科，能形成芽孢（内生孢子）的杆菌或球菌。包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属等。它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。芽孢杆菌bacillus杆菌科的一属细菌。实验原理特性1.繁殖快速：代谢快、繁殖快，四小时增殖10万倍，标准菌四小时仅可繁殖6倍。2.生命力强：无湿状态可耐低温－60℃、耐高温+280℃，耐强酸、耐强碱、抗菌消毒、耐高氧（嗜氧繁殖）、耐低氧（厌氧繁殖）。3.体积大：体积比一般病源菌分子大四倍数，占据空间优势，抑制有害菌的生长繁殖。有益芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌可用于植物保护，杀灭害虫；枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌可用于畜牧水产饲料添加剂、用于水环境净化；多粘类芽孢杆菌具有固定分子态氮的能力。芽孢杆菌生物工程芽孢杆菌各属拥有各自生物学特性，通过基因选育等生物工程学，可以将自然界的菌种人工选育出特定功能强势的菌种，应用于工农业生产各个方面。在抗生素污染问题越来越严重的今天，有益的芽孢杆菌的应用研究，可能是解决抗生素问题的一个有效方案。适合芽孢杆菌的培养基1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+20gq琼脂，或牛肉膏蛋白胨配方(1000ml)加10g的葡萄糖。ph为7即可。LB培养基成分:胰蛋白胨(Tryptone)10g/L酵母提取物(Yeastextract)5g/L氯化钠(NaCl)10g/L琼脂15~20g水1000ml诱变方法物理诱变应用较多的是辐射诱变，即用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外辐射以及微波辐射等物理因素诱发变异化学诱变化学诱变除能引起基因突变外，还具有和辐射相类似的生物学效应，如引起染色体断裂等，常用于处理迟发突变，并对某特定的基因或核酸有选择性作用。化学诱变剂主要有：①烷化剂。这类物质含有1个或多个活跃的烷基，能转移到电子密度较高的分子中去，置换其他分子中的氢原子而使碱基改变。常用的有甲基磺酸乙酯(EMS）、乙烯亚胺（EI）、亚硝基乙基脲烷（NEU）、亚硝基甲基脲烷（NMU）、硫酸二乙酯（DES）等。②核酸碱基类似物。为一类与DNA碱基相类似的化合物。渗入DNA后，可使DNA复制发生配对上的错误。常用的有5-溴尿嘧啶(BU）、5-溴去氧尿核苷（BudR）等。③抗生素。如重氮丝氨酸、丝裂毒素C等，具有破坏DNA和核酸的能力，从而可造成染色体断裂。淘汰野生型菌株的方法有抗生素法：细菌用青霉素法：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处休止状态的细菌。将诱变处理后的菌悬液分离加有抗生素的基本培养基上，培养后野生型细胞由于正常生长繁殖而被杀死，营养缺陷型细胞因不能生长而被保留下来，达到富集目的。酵母菌用制霉素法：制霉素作用于真菌细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集营养缺陷型的作用。高温杀菌法：利用芽孢杆菌类的芽孢和营养体对热敏感性的差异，让诱变后的细菌形成芽孢，然后把处在芽孢阶段的细菌移到基本培养液中，振荡培养一定时间，野生型芽孢萌发，而营养缺陷型芽孢不能萌发。此时将培养物加热到80℃，维持一定时间，野生型细胞大部分被杀死，缺陷型则得以保留，起到了浓缩作用。菌丝过滤法：真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌发长成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能萌发。把诱变处理后的孢子移入到基本培养液中，振荡培养10h左右，使野生型孢子萌发的菌丝刚刚肉眼可见，用灭菌的脱脂棉、滤纸或玻璃漏斗除去菌丝。继续培养，每隔3~4h过滤一次，重复3~4次，最大限度地除去野生型细胞。然后稀释、涂皿分离。营养缺陷型的检出点植对照法法诱变后的孢子或菌体，经富集培养，涂布分离在完全培养基平板进行培养，待菌落孢子成熟后，用灭菌的牙签或接种针把每个菌落上孢子或菌体分别接到基本培养基和完全培养基平板上的相应位置，同时培养，然后观察对比菌落生长情况。如果基本培养基上不生长而完全培养基相应位置上生长的菌落，可能为营养缺陷型。挑取孢子或菌体分别移接到基本培养基和完全培养基斜面上，进一步复证。该法可靠性强，但工作量大。影印法经富集后的孢子或菌体分离在完全培养基培养至菌落成熟（母皿），用灭菌后的特制“丝绒印模”在母皿平板菌落上轻轻一印，再转印到方位相同的另一基本培养基和完全培养基的平板上。培养后观察比较菌落生长情况，凡是在基本培养基上不生长，而在完全培养基上生长的菌落，分别移接到以上两种培养基斜面上进一步复证。另外还可采用更简便的方法，以上印模从母皿中沾上菌体细胞后，仅影印在基本培养基平板上，培养后，生长的菌落情况与存放于冰箱的母皿菌落比较即可检出营养缺陷型。本法适用于细菌、酵母菌，其次对小型菌落的放线菌和霉菌也适用。限量补充培养法如果试验的目的仅是检出营养缺陷型菌株，则其该法是将富集培养后的细胞接种到含有0.01%蛋白胨的基本培养基上，培养后，野生型细胞迅速地长成大菌落，在平皿底部作好颜色标记，而生长缓慢的小菌落可能是缺陷型，此称限量培养。如果试验的目的是要定向筛选某种特定的缺陷型，则可在基本培养基中加入某种单一的氨基酸、维生素或碱基等物质，称为补充培养。夹层培养法先在培养皿上倒一薄层基本培养基，凝固后再倒一层经过诱变处理的菌液，其上再浇一层基本培养基；经培养后，对首次出现的菌落用记号笔在皿底标记，然后再倒一层完全培养基，再培养，出现的形态较小的新菌落，多为缺陷型实验内容简介本实验以芽孢杆菌为实验材料，通过诱变处理，本组采用紫外诱变处理，产生氨基酸营养缺陷性菌株，再通过抗生素法淘汰野生型菌种，用影印法检出缺陷性的菌株，并对缺陷性菌株进行鉴定具体步骤及时间安排第一周实验设计与准备，与小组成员进行讨论认真分析实验题目，确立实验方法，与步骤第二周，按如下比例配置，但是用量整体降为原来的十分之一，即蒸馏水由1L降到100ml:1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+琼脂20克，或牛肉膏蛋白胨配方法(1000ml)加10g的葡萄糖,调ph为7。灭菌后，将菌种接到培养基上培养。1第三周，本组实验为了不引入其他化学物质所以采用紫外诱变处理，首先将实验材料—芽孢杆菌配置成菌悬液。按如下比例配置，但是用量整体降为原来的十分之一，即蒸馏水由1L降到100ml:1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏，或牛肉膏蛋白胨配方(1000ml)加10g的葡萄糖。ph为7即可。进行灭菌后，将培养的芽孢杆菌接种到液体培养基中，制成菌悬液。将菌悬液置于紫外灯下进行照射990S，然后进行遮光培养48小时。进行中间培养3代以上。2第四周，中间培养后，进行淘汰野生型操作。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处休止状态的细菌。将诱变处理后的菌悬液分离加有抗生素的基本培养基上，培养后野生型细胞由于正常生长繁殖而被杀死，营养缺陷型细胞因不能生长而被保留下来，达到富集目的。具体操作，吸菌液5ml于离心管中，3500rpm离心10min，弃上清。离心洗涤两次（加生理盐水至原体积，打匀沉淀，离心，弃上清，重复一次），最后加生理盐水制成5ml菌悬液。取0.1ml菌液于5ml无N培养基中，37℃培养12h。（消耗体内的N素，使停止生长，避免缺陷型被以后加入的青霉素杀死）4thday，初筛：按1:1比例加入2N基本培养液5ml，加5万U/ml青霉素钠盐溶液100ul，使青霉素在溶液中的最终浓度约为500U/ml，再放入37℃培养。（野生型利用氮大量生长，细胞壁不能完整合成而死亡。缺陷型因不长避免被杀死）。5thday，从培养12、14、16、24小时（根据实际情况，选择2-3个时间段）的菌液中分别取0.1ml菌液到基本及完全培养基两个培养皿中，涂布，37℃培养。3第五周，突变菌株的检出。经富集后的菌体分离在完全培养基培养至菌落成熟（母皿），用灭菌后的特制“丝绒印模”在母皿平板菌落上轻轻一印，再转印到方位相同的另一基本培养基和完全培养基的平板上。培养后观察比较菌落生长情况，凡是在基本培养基上不生长，而在完全培养基上生长的菌落，分别移接到基本培养基和完全培养基两种培养基斜面上进一步培养观察。4第六周，氨基酸缺陷型的鉴定。在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对许多种生长因子的需求情况为生长谱法单一生长因子：鉴定氨基酸或维生素的营养缺陷型，较为简便的方法是分组测定法。将21种氨基酸，组合6组，每6种不同氨基酸归为一组。组别氨基酸组合组1赖氨酸精氨酸蛋氨酸胱氨酸亮氨酸异亮氨酸2缬氨酸精氨酸苯丙氨酸酪氨酸色氨酸组氨酸3苏氨酸蛋氨酸苯丙氨酸谷氨酸脯氨酸天冬氨酸4丙氨酸胱氨酸酪氨酸谷氨酸甘氨酸丝氨酸5鸟氨酸亮氨酸色氨酸脯氨酸甘氨酸谷氨酰胺6胍氨酸异亮氨酸组氨酸天冬氨酸丝氨酸谷氨酰胺5将检出的营养缺陷型菌落接种于5mlLB液试管中，37℃培养14－16。培养16h的菌液离心。3500rpm，10min，弃上清，加生理盐水，打匀沉淀，再次离心。加5ml生理盐水制成菌悬液。取其1ml于培养皿中，加入融化后冷却到40－50℃的基本培养基，混匀，平放，共二皿。（平板表面分别沾上沾有混合氨基酸(或酪素水解液)的滤纸片，30℃培养24h，经培养后营养物质周围有生长圈，即表明为氨基酸的营养缺陷型菌株）。将皿底分成分格用接种环依次放入少许混合氨基酸等，37℃培养24h，观察生长情况，确定是哪种氨基酸营养缺陷型。