超临界流体制备犅犛犃包衣微丸及释药特性

　复旦学报（医学版）ＦｕｄａｎＵｎｉｖＪＭｅｄＳｃｉ２００８Ｍａｙ，３５（３）超临界流体制备犅犛犃包衣微丸及释药特性肖菊香　马晓文　莫　炜　宋后燕△（复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系－分子医学教育部重点实验室　上海　２０００３２）【摘要】　目的　采用自行设计的ＣＯ２超临界流体（ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｃａｒｂｏｎｄｉｏｘｉｄｅ，ＳｃＣＯ２）包衣设备研究肠溶包衣参数，为开发蛋白质及多肽的口服制剂提供工艺基础。方法　以载牛血清白蛋白（ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ，ＢＳＡ）颗粒为微丸核心，以ＥＵＤＲＡＧＩＴＬ１００－５５作为ｐＨ敏感的肠溶包衣材料，采用正交表研究压力、温度、增塑剂和包衣持续时间等不同的工艺参数组合，并考察肠溶包衣微丸的形态学和体外释放特性，以选择最优的二氧化碳超临界流体包衣工艺。结果　压力为２０ＭＰａ、温度为３５℃、使用４０％增塑剂的条件下包衣３０ｍｉｎ，所得ＢＳＡ微丸在模拟胃液中释放量小于５％，在模拟肠液中迅速释放，符合肠溶包衣的要求。结论　得到了通过ＳｃＣＯ２制备肠溶微丸的最优参数组合，为二氧化碳超临界流体包衣的进一步研究提供了基础。【关键词】　二氧化碳超临界；　蛋白质；　肠溶包衣【中图分类号】　Ｒ９４４．５　　【文献标识码】　Ａ　△Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ　Ｅｍａｉｌ：[e-mail]犘狉犲狆犪狉犪狋犻狅狀狅犳犅犛犃狆犲犾犾犲狋狊犫狔狊狌狆犲狉犮狉犻狋犻犮犪犾犮犪狉犫狅狀犱犻狅狓犻犱犲犳犾狌犻犱犪狀犱犻狀狏犻狋狉狅犲狏犪犾狌犪狋犻狅狀ＸＩＡＯＪｕｘｉａｎｇ，ＭＡＸｉａｏｗｅｎ，ＭＯＷｅｉ，ＳＯＮＧＨｏｕｙａｎ△（犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犕狅犾犲犮狌犾犪狉犕犲犱犻犮犻狀犲，犕犻狀犻狊狋狉狔狅犳犈犱狌犮犪狋犻狅狀犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犅犻狅犮犺犲犿犻狊狋狉狔牔犕狅犾犲犮狌犾犪狉犅犻狅犾狅犵狔，犛犺犪狀犵犺犪犻犕犲犱犻犮犪犾犆狅犾犾犲犵犲，犉狌犱犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犛犺犪狀犵犺犪犻，２０００３２，犆犺犻狀犪）【犃犫狊狋狉犪犮狋】　犗犫犼犲犮狋犻狏犲　ＴｏｐｒｅｐａｒｅｅｎｔｅｒｉｃｃｏａｔｅｄＢＳＡｐｅｌｌｅｔｓｂｙｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｃａｒｂｏｎｄｉｏｘｉｄｅ（ＳｃＣＯ２）ａｎｄｔｏｓｃｒｅｅｎａｎｏｐｔｉｍｕｍｃｏａｔｉｎｇａｒｔｂｙＳｃＣＯ２．　犕犲狋犺狅犱狊　ＡｎＬ９（３４）ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔａｂｌｅｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄｔｏｓｅｌｅｃｔａｎｏｐｔｉｍｕｍｃｏａｔｉｎｇａｒｔｂｙＳｃＣＯ２，ＢＳＡｐｅｌｌｅｔｓｗｅｒｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｂｙｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄ犻狀狏犻狋狉狅ｒｅｌｅａｓｅｐｒｏｆｉｌｅ．　犚犲狊狌犾狋狊　犐狀狏犻狋狉狅ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＢＳＡｐｅｌｌｅｔｓｃｏａｔｅｄｂｙｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆ２０ＭＰａ，３５℃，４０％ｐｌａｓｔｉｃｉｚｅｒｆｏｒ３０ｍｉｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｕｍｕｌａｔｉｖｅｒｅｌｅａｓｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆＢＳＡｉｎ０．１ｍｏｌ／ＬＨＣｌｗａｓｌｅｓｓｔｈａｎ５％．　犆狅狀犮犾狌狊犻狅狀狊　ＡｎｏｐｔｉｍｕｍｃｏａｔｉｎｇａｒｔｂｙＳｃＣＯ２ｈａｓｂｅｅｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｓｃｒｅｅｎｅｄａｎｄｅｎｔｅｒｉｃｃｏａｔｅｄＢＳＡｐｅｌｌｅｔｓａｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｐｒｏｄｕｃｅｄ．【犓犲狔狑狅狉犱狊】　ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｃａｒｂｏｎｄｉｏｘｉｄｅｆｌｕｉｄ；　ｐｒｏｔｅｉｎ；　ｅｎｔｅｒｉｃｃｏａｔｅｄ　　１９世纪８０年代，Ｈａｎｎａｙ等发现超临界流体（ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｆｌｕｉｄ，ＳＣＦ）具有显著的溶解能力。到了２０世纪后期超临界萃取技术（ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｆｌｕｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＳＦＥ）蓬勃发展，在我国被广泛应用于中药有效成份的提取［１，２］。除了在萃取领域的广泛应用外，超临界流体技术在其他方面的应用优势也日渐受到重视。其中超临界流体超微粉体的制备技术和基于超临界流体的包覆技术在医药食品以及生物材料的包埋上已经开始研究和应用［３，４］。目前，ＳｃＣＯ２技术在制备微球［５］方面已得到广泛的应用。而在利用ＳｃＣＯ２技术进行造粒方面，Ｍａｒｔｉｎ等［６］利用ＳｃＣＯ２制备得到含有蛋白质和高分子材料的微粒，王亭杰等［７］利用ＳｃＣＯ２作为溶剂，在微粒约为１３０μｍ的模拟药物载带颗粒的玻璃珠表面实现了石蜡的包覆造粒。众所周知，利用生物技术开发的蛋白质及治疗性多肽类药物发展迅速，许多种类已经进入临床使用。但其传统的给药方式仍然是注射给药，这不仅给病人带来了治疗和经济上的困难，而且限制了药物对心血管等慢性疾病的治疗，因此多肽及蛋白质类药物口服制剂的研究被提上日程。但是传统的药物包覆技术要借助于有机溶剂来溶解包覆剂，有机０８３　肖菊香，等．超临界流体制备ＢＳＡ包衣微丸及释药特性溶剂会使蛋白质及多肽类药物的活性丧失，因而蛋白质口服剂型的研制成为难题。ＳｃＣＯ２技术可避免或减少有机溶剂的使用，同时ＣＯ２可以循环利用以降低成本。本文旨在将ＳｃＣＯ２的这种特有性质引入到蛋白质口服微丸制剂的研制过程中，开发不利用有机溶剂进行蛋白质及多肽类药物包覆的绿色工艺。材料和方法仪器　Ｇｌａｔｔｍｉｎｉ３流化床（德国Ｇｌａｔｔ公司）；ＨＡ超临界二氧化碳流体包衣装置（南通华安超临界萃取有限公司）；Ｓ５２０型扫描电镜（日本ＨＩＴＡＣＨＩ公司）；紫外分光光度计（日本岛津ＵＶ２６０）。试药　牛血清白蛋白（ＢＳＡ，上海捷贝思基因技术有限公司）；空白丸芯（乳糖型，７１０／８５０μｍ，上海运宏化工有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰｋ３０，国际特品公司）；ＥＵＤＲＡＧＩＴＬ１００５５（德国罗姆公司）；柠檬酸三乙酯（ＴＥＣ，美国Ｓｉｇｍａ公司）。载犅犛犃丸芯的制备　以３０％ＰＶＰ水溶液为粘合剂，搅拌下将ＢＳＡ溶解其中制成溶液，将空白丸芯加入包衣机中，采用底喷法载药。包衣机各参数设定如下：喷嘴直径１ｍｍ，进风温度３９℃，床内温度３５℃，雾化压力１．２ｂａｒ，流化压力０．５ｂａｒ，喷液速率０．６ｍＬ／ｍｉｎ。喷药结束后继续进风１０ｍｉｎ使小丸干燥。按下式计算微丸的上药率：上药率＝（药物实际含量／药物理论含量）×１００％犅犛犃包衣微丸的工艺筛选　所采用的超临界二氧化碳流体包衣装置设备如图１所示，包覆过程在静态反应釜内完成，静态反应釜为密闭装置，设有二氧化碳进气口和二氧化碳放气口，上端配置了有调速电压控制的搅拌棒。包衣反应的模式图如图２所示：将载药丸芯与包衣材料同时加入静态反应釜，向其中通入二氧化碳气体，控制反应釜内的压力和温度使二氧化碳流化（二氧化碳的临界压力＝７．２８ＭＰａ，临界温度＝３１．６℃），然后开启搅拌棒使反应釜内容物发生充分的混匀。搅拌结束后，打开放气口使反应釜内压力下降，二氧化碳流体迅速变为气体释放出去。气体释放完全后取出包衣微丸即可。图１　超临界二氧化碳流体包衣装置示意图犉犻犵１　犛犮犺犲犿犪狋犻犮犱犻犪犵狉犪犿狅犳狊狌狆犲狉犮狉犻狋犻犮犪犾犮犪狉犫狅狀犇犻狅狓犻犱犲犮狅犪狋犻狀犵犿犪犮犺犻狀犲图２　静态反应釜包衣流程示意图犉犻犵２　犛犮犺犲犿犪狋犻犮犱犻犪犵狉犪犿狅犳狊狌狆犲狉犮狉犻狋犻犮犪犾犮犪狉犫狅狀犱犻狅狓犻犱犲犮狅犪狋犻狀犵狆狉狅犮犲狊狊　　犅犛犃包衣微丸的检测形态学检测　使用扫描电镜检测了ＢＳＡ包衣微丸的外观特点，以检测在二氧化碳超临界流体中包衣材料的包覆情况。１８３复旦学报（医学版）　２００８年５月，３５（３）　体外释放实验　按《中国药典》２０００年版二部附录ＸＤ第２法测定。采用０．１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ溶液和ｐＨ６．８ＰＢＳ溶液模拟胃和肠道环境，称取小丸适量，先将小丸加入０．１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ７５０ｍＬ中释放２ｈ，保持温度为３７℃，转速为１００ｒ／ｍｉｎ，定时取样，同时补充等量等温介质。然后往ＨＣｌ溶液里加入０．２ｍｏｌ／ＬＮａ３ＰＯ４２５０ｍＬ溶液，调整其ｐＨ值为６．８，保持其他条件，定时定点取样。将得到样本迅速用０．８μｍ滤膜过滤，取续滤液测定吸收度并根据标准曲线计算累计释放度。ＢＳＡ标准曲线制备方法如下：分别用０．１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ及ｐＨ６．８ＰＢＳ配制一定浓度的ＢＳＡ溶液，于２００－４００ｎｍ的波长范围内进行紫外扫描，确定其敏感吸收峰。同时用相应同种介质对处方量的辅料进行稀释，观察其在敏感波长处是否干扰。随后，分别用这两种介质将ＢＳＡ做梯度稀释后读取敏感波长处的吸收度，通过线性回归作出标准曲线。犅犛犃包衣微丸的制备　以筛选所得的工艺参数制备ＢＳＡ包衣微丸，并通过检测其体外释放特性评价该工艺参数的可行性。结　　　果载药微丸上药率的计算　通过流化床底喷法制备的载药微丸均匀圆整，称取载药微丸研磨溶解后，用０．８μｍ滤膜过滤，取续滤液测定吸收度。最后得到小丸上药率为９７．６％。犅犛犃肠溶微丸的制备　蛋白质或治疗性多肽类药物在酸性环境中容易变性失活，因而在制备口服制剂时通常将其设计成肠溶的形式。ＥＵＤＲＡＧＩＴＬ１００－５５是一种在ｐＨ５以上特定溶解的肠溶材料，可以使蛋白质避免暴露在胃酸环境中从而保护药物的活性。由于超临界ＣＯ２流体的溶解能力与流体的温度、压力等有着密切的关系，所以在包衣过程中要考察不同参数设置对包衣效果带来的影响，使其真正达到肠溶的目的，即《中国药典》２０００年版中规定微丸的酸中累计释放度＜５％。本文选用ＢＳＡ微丸在模拟胃酸中２ｈ的累计释放度为参考指标，采用Ｌ９（３４）正交表考察在包衣过程中设置的不同参数对包衣效果的影响（表１），以寻找最合适的工艺路线。从表中可以看出，药物在酸中累积释放度最小的参数组合为Ａ３Ｂ３Ｃ３Ｄ３。从各包衣参数的组合结果看，反应罐内压力和增塑剂的使用对肠溶包衣微丸的制备影响较大，增加增塑剂的使用量可以明显提高包衣效率，显著降低微丸的酸中释放度，提示其对包衣材料的成膜机制有重要作用，原因在于增塑剂可以降低ＥＵＤＲＡＧＩＴ材料的玻璃化温度，促进其在较低温度下成膜。表１　包衣方法参数筛选犜犪犫１　犜犺犲狅狆犲狉犪狋犻狀犵狆犪狉犪犿犲狋犲狉狊狅犳犅犛犃狆犲犾犾犲狋狊ＢａｔｃｈＡＢＣＤＡｃｃｕｍｕｌａｔｉｖｅｒｅｌｅａｓｅｉｎａｃｉｄｐｅｒｉｏｄ（％）１１０３２０１５７７．４２１０３５３０３０２９．２３１０４０４０６０２４．４４１５３２３０６０１２．６５１５３５４０１５１２．６６１５４００３０３１．９７２０３２４０３０４．２８２０３５０６０２４．８９２０４０３０１５２．３Ｋ１４３．７３１．４４４．７３０．８Ｋ２１９２２．２１４．７２１．８Ｋ３１０．４１９．５１３．７２０．６Ｒａｎｇｅ３３．３１１．９３１１０．２　　Ａ：Ｃｏａｔｉｎｇｐｒｅｓｓ（ＭＰａ）；Ｂ：Ｃｏａｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）；Ｃ：ＰｌａｓｔｉｃｉｚｅｒＴＥＣ（％）；Ｄ：Ｃｏａｔｉｎｇｔｉｍｅ（ｍｉｎ）；Ｋ：Ｍｅａｎ（％）．　　犅犛犃肠溶微丸形态学检测　ＢＳＡ肠溶微丸的扫描电镜照片如图３所示。１号微丸在未使用增塑剂的条件下，表面有大量颗粒状包衣材料的覆盖。７号微丸在包衣过程中使用增塑剂后，电镜照片显示包衣材料在其表面形成了致密的肠溶衣薄膜。结合上述微丸在酸中的累计释放度情况，可见微丸表面的包衣形态决定了其肠溶的效果。致密的包衣薄膜才能够使微丸达到肠溶的目的，从而使蛋白质或多肽类药物的活性不受胃液酸性环境的破坏。犅犛犃肠溶微丸体外释放实验　本文测定了不同工艺制备的微丸在０．１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ溶液和ｐＨ６．８ＰＢＳ溶液模拟的胃和肠道环境中的释放度，如图４所示。可见，ＢＳＡ在酸中的释放度各不相同，但是进入碱液模拟的人工肠液后迅速释放。其中，７号和９号微丸的酸中累积释放度均＜５％，达到了肠溶的目的。犅犛犃包衣微丸的制备　通过正交实验得到的工艺参数为：反应罐内压力２０ＭＰａ，温度４０℃，以４０％ＴＥＣ为增速剂，包衣持续时间６０ｍｉｎ。但是由于４０℃的温度可能会损伤蛋白质的生物活性，而３０ｍｉｎ的反应时间已足够原料搅拌均匀，所以我们在进一步研究中采用Ａ３Ｂ２Ｃ３Ｄ２组合，即包衣反应罐内压力为２０ＭＰａ，温度为３５℃，以