第三章 动物细胞培养基础

1第三章动物细胞工程的实验室基础•第一节实验室基本操作技术动物细胞与胚胎工程的操作对象，对操作器具带来的毒性非常敏感，体外培养中任何与培养物相接触的有害物质都会影响培养物的体外生长和增殖，诸如微生物、细胞碎片以及非营养性化学物质等都可能干扰正常的实验结果。培养工作开始之前，对实验室所使用的培养器具进行彻底清洗、灭菌，清除可能残存的细胞毒性物质。动物细胞与胚胎工程实验室基本操作技术主要包括清洗、消毒灭菌(sterilization)、无菌操作及实验室维持等基本环节。2第一节实验室基本操作技术一、清洗与包装(一)物品清洗新的或用后的各种器皿，包括玻璃器皿、塑料器皿、金属器械、除菌滤器等都应严格清洗。3清洗和消毒过程4第一节实验室基本操作技术一、清洗与包装配制洗液的方法是：①按照上述配方，将需要量的重铬酸钾和蒸馏水加到选用的容器内；②向容器内缓慢、分次加入浓硫酸(工业硫酸即可)，轻轻搅拌溶液，以加快散热及促进重铬酸钾溶解。加入浓硫酸时切勿过急，以免液体骤热，发生危险；③自然冷却。5一、清洗与包装(二)清洗后物品的包装洗净烘(晾)干的物品应及时包装，以备消毒灭菌。包装的物品也便于消毒灭菌和贮存，同时可防止消毒灭菌后再受污染。包装常用硫酸纸、牛皮纸、纱布、棉布、锡箔纸、铝盒、饭盒、专用金属消毒筒等。包装的方式根据消毒灭菌的方法而有所不同。6培养器皿7金属器材8辅助器材•加样器•支架•离心管•冷冻管9二、消毒灭菌(一)消毒灭菌方法目前常用的消毒灭菌方法多采用物理方法(如干热灭菌法、湿热灭菌法、过滤除菌法、射线杀菌法等)、化学方法（消毒剂）以及抗生素(青霉素、链霉素、庆大霉素等)三大类。10二、消毒灭菌(一)消毒灭菌方法1．干热灭菌法是利用恒温干燥箱内120ºC～150ºC的高热，并保持90～120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的的一种方法。主要适用于不便在压力蒸汽灭菌器中进行灭菌，且不易被高温损坏的玻璃器皿、金属器械以及不能和蒸汽接触的物品的灭菌。11二、消毒灭菌(一)消毒灭菌方法2．湿热灭菌法压力蒸汽湿热灭菌法是目前最常用的一种灭菌方法。它利用高压蒸汽以及在蒸汽环境中存在的潜热作用和良好的穿透力，使菌体蛋白质凝固变性而使微生物死亡。适合于布类工作衣、各种器皿、金属器械、胶塞、蒸馏水、棉塞、纸和某些培养液的灭菌。高压蒸汽灭菌器的蒸汽压力一般调整为1.0～1.1kg/cm2，维持20～30min即可达到灭菌效果。12二、消毒灭菌(一)消毒灭菌3．射线灭菌法利用紫外线灯进行照射灭菌的方法。紫外线是一种低能量的电磁辐射，可以杀灭多种微生物。紫外线的作用机制是通过对微生物的核酸及蛋白质等的破坏作用而使其灭活。适合于实验室空气、地面、操作台面灭菌。灭菌时间为30min。用紫外线杀菌时应注意，不能边照射边进行实验操作，因为紫外线不仅对人体皮肤有伤害，而且对培养物及一些试剂等也会产生不良影响。13二、消毒灭菌(一)消毒灭菌4．过滤除菌法是将液体或气体通过有微孔的滤膜过滤，使大于滤膜孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌的方法。过滤除菌法大多用于遇热易发生分解、变性而失效的试剂、酶液、血清、培养液等。目前，常用微孔滤膜金属滤器或塑料滤器正压过滤除菌，或用玻璃细菌滤器、滤球负压过滤除菌。滤膜孔径应在0.22～0.45μm范围内或用更小的细菌滤膜，溶液通过滤膜后，细菌和孢子等因大于滤膜孔径而被阻，并利用滤膜的吸附作用，阻制小于滤膜孔径的细菌透过。14天平和真空泵15二、消毒灭菌(一)消毒灭菌5．化学消毒剂消毒法用于那些不能利用物理方法进行灭菌的物品、空气、工作面、操作者皮肤、某些实验器皿等。常用的化学消毒剂包括甲醛、高锰酸钾、70%～75%乙醇、过氧乙酸、来苏尔水、0.1%新洁尔灭、环氧乙烷、碘伏或碘酊等。其中利用70%～75%乙醇、0.1%～0.2%氯化汞、10%次氯酸钠、饱和漂白粉等进行实验材料的灭菌；利用甲醛加高锰酸钾[(2ml甲醛+1g高锰酸钾)/m3]或乙二醇(6ml/m3)等加热熏蒸法进行无菌室和培养室的消毒。16二、消毒灭菌(一)消毒灭菌6．抗生素法主要用于培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段以及作为微生物污染不严重时的“急救”措施。常用的抗生素有青霉素、链霉素和新霉素等。17二、消毒灭菌18三、无菌操作树立“无菌”意识并落实到行动中！19第二节培养液及其配制•进行动物细胞、配子及胚胎的体外培养离不开适应其在体外生存和生长的各种溶液，即培养用液。培养液是离体培养组织和细胞赖以生存的营养基质，为离体培养材料提供的近似生物体内生存的营养环境。20第三节培养液及其配制•一、培养液的成分培养动物细胞用的生长培养液组分包括9种：①水；②无机盐；③微量元素；④维生素；⑤缓冲系统；⑥能源和碳源；⑦氮源；⑧激素和生长因子；⑨添加剂。21一、培养液的成分•1．水水是培养用液最主要的溶剂。培养用液中的其他成分只有溶解于水中才有利于细胞吸收摄取。水也是细胞的主要组成成分之一，在细胞内主要起溶剂作用。细胞吸收的营养物质、分泌的产物、代谢的废物都要溶解在水中；细胞内的化学反应、细胞的运动及维持细胞内外的渗透压也离不开水。所以水是离体培养细胞的最基本的生存环境。22一、培养液的成分•1．水三蒸水或超纯水保存时间短23纯化水装置24一、培养液的成分•2．无机盐解决培养细胞短期生存问题，唯一重要的因素是渗透压。用于培养细胞的培养液的渗透压必须接近或等于细胞本身的渗透压，即等渗溶液，否则细胞就会失水皱缩或吸水膨胀而死亡。对于哺乳动物细胞来说，渗透压与正常状态相差10%，细胞的生存就会大受影响。25一、培养液的成分•2．无机盐26一、培养液的成分•3．微量元素缺乏稀有微量元素的培养液对任何真核细胞的培养都是不合适的。培养液中微量元素的含量通常都很低，一般小于1g/L。一般情况下，水和无机盐中已含有足够量的微量元素，因此多数动物细胞培养液中不需要另加微量元素。27一、培养液的成分•4．维生素动物细胞培养需要维生素，而且动物细胞对维生素种类的要求通常比植物细胞要多一些。28一、培养液的成分•5．缓冲系统缓冲系统对维持培养液的pH值是至关重要的。理想的缓冲液应有以下几个特点：①能持续地维持培养液的pH值恒定；②不干扰在培养液中进行的化学或生物化学反应；③不影响实验和观察。29一、培养液的成分•5．缓冲系统体外培养应用最广泛的缓冲剂为碳酸氢钠／碳酸(NaHCO3／H2CO3)，其次是磷酸盐缓冲对(NaH2PO4／Na2HPO4)。培养液内一般加入了酚红作为pH指示剂。30一、培养液的成分•6．能源和碳源葡萄糖是动物细胞的主要能源，大多数动物细胞靠1～4g/L葡萄糖获取能量。丙酮酸、琥珀酸和肌酸等碳源也常常成为动物细胞的补充能源。当不要求所培养的动物细胞以最大速度生长时，可以用半乳糖代替葡萄糖加入培养液中。31一、培养液的成分•7．氮源动物细胞合成蛋白质和核酸的氮源有两种：成分明确的氮源和成分不明确的氮源。(1)成分明确的氮源指动物细胞合成蛋白质和生长所必不可少的一些必需氨基酸和非必需氨基酸。(2)成分不明确的氮源指动物细胞培养液中加入的各种动物血清(serum)、组织提取液以及蛋白水解产物(如水解乳蛋白)等，其中血清是体外培养中用得最多最广的天然培养液，绝大部分动物细胞的体外培养都要使用血清。32一、培养液的成分•血清是大多数生长培养液的一个成分，在动物细胞生长培养液中起着多方面十分重要的作用：A能提供细胞生存、生长和增生所必需的生长调节因子；B能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分；C含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分；D提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等，载体蛋白还可使被结合的物质稳定或改变性质；E在一些情况下，血清有中和毒性物质保护细胞不受伤害的作用；给培养液提供良好的缓冲系统；提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受死细胞释放的蛋白酶的损害。33一、培养液的成分•血清的影响虽然血清对体外培养动物细胞的生长和增殖有着重要的作用，但并非培养液中的血清越多越好，而且血清对培养细胞还存在一些不良的影响：A.血清中存在一些不利于细胞生长和繁殖的物质，如补体、免疫球蛋白、病毒、支原体和一些生长抑制因子等；B.血清的成分不明确，影响对结果的分析；C.不同动物、不同批次血清的成分和活性差异较大，使培养结果不稳定，实验重复性差。34一、培养液的成分•血清中的补体成分对一些细胞可能有细胞毒性作用，购回的商品血清应作热灭活处理。方法是：将血清解冻后，置水浴箱中于56℃孵育30min。•动物细胞培养使用的血清有胎牛血清(fetalbovineserum，FCS)、新生牛血清(new-borncalfserum,NCS)、成年牛血清(adultbovineserum)、马血清(horseserum)、鸡血清(chickenserunl)、兔血清(rabbitserum)、羊血清(sheeporgoatserum)以及人血清(humanserum)等。其中以胎牛血清、新生牛血清应用最广泛，一般来讲，动物愈年轻，其血清愈有利于细胞生长，所以成年牛血清不如小牛血清(calfserum)，小牛血清又不如胎牛血清(fetalbovineserum，FCS)。35一、培养液的成分•8．生物活性因子•生物活性因子都是培养动物细胞生长和增殖必不可少的物质。36一、培养液的成分•9．添加剂•抗生素黏滞性37一、培养液的成分•9．添加剂•抗生素黏滞性38一、培养液的成分•9．添加剂•抗生素黏滞性39二、培养液的制备•在体外培养技术的发展过程中，培养液配方的设计一直是重要的研究课题。研究者模拟、借鉴细胞在体内生存生长的各种条件，设计出类似体内环境而适宜细胞在体外生存的各种培养液。40超净工作台41二、培养液的制备•第一个合成培养液是由Lewis于1911年设计的，仅含有几种盐类和糖类。合成培养液一般只能短期维持细胞生存，必须补加血清后才能作为生长培养液。目前，合成培养液的种类已达几十种之多，如MEM(minimalessentialmedium)，DMEM，DMEM/F12，Ham’sF12，RPMI-1640，M199，TC199等。下面列出了Eagle’sMEM培养液的配方。42二、培养液的制备•43三、动物细胞体外培养的其他常用液•在动物细胞体外培养中，除以上介绍的几大类培养用液外，还有一些其它必不可少的常用液。主要包括分离细胞的消化液、中止酶消化作用的消化酶抑制剂、调整培养液酸碱度的pH调整液和防止微生物污染的抗生素液等。44CO2培养箱