微生物限度检验

1微生物限度检验方法验证2007.42微生物限度检查(MicrobialLimitsTest)：是指非无菌制剂及原，辅料受到微生物污染程度的检查。包括：1）细菌计数；2）霉菌及酵母菌计数；3）控制菌检查：大肠杆菌，沙门菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，大肠菌群3细菌、霉菌及酵母菌计数样品10g或10ml+90ml缓冲液总需氧菌TSA,35℃,48-72h真菌SDA(PDA),20-25℃,5-7d结果(cfu/ml)取1ml样品4控制菌检查(EP)肠杆菌和G-杆大肠杆菌沙门菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌梭菌10g(10ml)样品10g(10ml)样品10g(10ml)样品10g(10ml)样品10g(10ml)样品10g(10ml)样品90ml乳糖肉汤35-37℃,2-5h90mlTSB35-37℃,18-48h90mlTSB35-37℃,18-24h90ml缓冲蛋白胨水90ml缓冲蛋白胨水100ml增强梭菌培养基35-37℃,48h,厌氧10ml加入100mlMossel肉汤(EE肉汤)35-37℃,18-48h1ml加入100mlMcConkey肉汤43-45℃,18-24h1ml加入10mlTTB肉汤41-43℃,18-24h10ml加入100mlTSB35-37℃,18-48h10ml加入100mlTSB35-37℃,18-48h含庆大霉素的哥伦比亚琼脂35-37℃,48h,厌氧VRBG琼脂35-37℃,18-24hMacConkey琼脂35-37℃,18-72h脱氧胆盐琼脂XLD琼脂亮绿(BG)琼脂35-37℃,18-72hCetrimide琼脂35-37℃,18-72hBairdParker琼脂35-37℃,18-72h哥伦比亚琼脂35-37℃,48h,厌氧和需氧计数产气荚膜梭菌5控制菌检查(USP)沙门菌大肠杆菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌10g或10ml样品10g或10ml样品10g或10ml样品10g或10ml样品90ml乳糖肉汤90mlTAT肉汤基础90ml乳糖肉汤90mlTAT肉汤基础90mlTSB90mlTAT肉汤基础90mlTSB90mlTAT肉汤基础1ml加入10ml1)SC肉汤2)TTB肉汤BS琼脂XLD琼脂亮绿(BG)琼脂MacConkey琼脂EMB琼脂Cetrimide琼脂假单胞菌分离琼脂BairdParker琼脂VJ琼脂甘露醇盐琼脂6控制菌的检测(中国药典05版)大肠杆菌大肠菌群沙门菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌梭菌1g(1ml)样品1g(1ml)样品10g(10ml)样品1g(1ml)样品1g(1ml)样品1g(1ml)样品X2100ml胆盐乳糖培养基35-37℃,18-24h3X10ml胆盐乳糖发酵管35-37℃,18-24h200ml营养肉汤35-37℃,18-24h100ml胆盐乳糖培养基35-37℃,18-24h100ml亚碲酸钾肉汤(或营养肉汤)35-37℃,18-24h(其中一份样品80℃,10分钟)100ml新鲜庖肉培养基厌氧,35-37℃,72-96h0.2ml加入5mlMUG培养基35-37℃,4h&24hMacConkey琼脂或EMB平板35-37℃,18-24h1ml加入10mlTTB肉汤41-43℃,18-24hMacConkey琼脂(或EMB平板)35-37℃,18-24h4-5个可疑菌落10ml乳糖发酵管35-37℃,18-24h胆盐硫乳琼脂DHL(或SS琼脂)MacConkey琼脂(或EMB平板)35-37℃,18-24h溴化十六烷基三甲铵Cetrimide琼脂35-37℃,18-72h甘露醇氯化钠琼脂(或卵黄氯化钠琼脂)35-37℃,18-72h0.2ml涂抹于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂厌氧,35-37℃,48-72h705版微生物限度检查法与英美比较比较项目ChP2005USP29BP2002检验条件规定总体10000级、局部100级无具体规定无具体规定计数测定方法平皿法、薄膜过滤法、MPN平皿法、薄膜过滤法,MPN平皿法、薄膜过滤法、MPN控制大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌(10)、铜绿假单胞菌、金葡球菌、梭菌、其他致病菌大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、金葡球菌、大肠菌群、肠道菌、肠杆菌科大肠埃希菌、沙门菌(10)、铜绿假单胞菌、金葡球菌；肠杆菌科及某些革兰阴性菌稀释液pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液；pH6.8/7.6PBS；0.9%NaClpH7.2PBS；大豆酪蛋白消化培养基/乳糖肉汤培养基pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液；乳糖肉汤/其他培养基培养条件与时间细菌数：营养琼脂，48hrs霉菌及酵母：玫瑰红钠琼脂，72hrs,5～7天需气菌总数：大豆酪蛋白消化物琼脂，48～72hrs霉菌及酵母：沙氏葡萄糖琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂，5～7天需气菌总数：大豆酪蛋白消化物琼脂，5天霉菌及酵母：含抗生素的沙氏葡萄糖琼脂、大豆酪蛋白消化物琼脂，5天控制菌检查结果判断与复试规定一次检出为准不符合标准规定，取大于25g的样品复试一次检出为准计数结果判断与复试规定第一次结果超过规定标准，复试两次，三次结果平均报告不符合标准规定，取大于25g的样品复试测定结果在规定的限度标准5倍以内均为合格8验证目的-在于确认（寻找）一种有效的检验方法，如果样品（药品）中有一定数量的微生物存在，那么采用此法可以使得样品（药品）中的微生物得以检出。-充分验证样品（药品）本身对微生物生长的影响。9验证目的确认一种检验方法。验证实验检验条件检验方法样品量稀释液种类稀释液体积中和剂培养基培养时间培养温度……SOP检验规程10影响微生物检验的因素-样品/药品自身的特殊性-样品/药品中添加的防腐剂/抑菌剂-培养基的特性-培养条件-人员因素-实验器材的选择11恢复试验-微生物方法验证的实质就是评价和考察微生物恢复试验（恢复生长）的可信度。-恢复试验就是确认某一检验方法，它可以使加入其中的各种微生物都能够恢复生长。12验证内容（一）计数方法验证（二）控制菌检验方法验证13微生物限度检验方法验证（一）计数方法验证14供试液制备（中国药典2005版）-表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。-供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。-供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。-供试液的体积：100ml。15稀释剂（中国药典2005版）（1）pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液（2）pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（3）pH7.6无菌磷酸盐缓冲液固体：10g供试品+稀释剂至100ml液体：10ml供试品+稀释剂至100ml16微生物计数方法验证菌种选择原则普遍性-G+、G-、-杆菌（长、短杆菌）-球菌-真菌（丝状真菌、酵母菌）特殊性-从环境中分离出来的常见杂菌-从样品中分离出来的常见杂菌17微生物计数方法验证用菌株：中国药典2005版菌株名称CMCC编号培养条件大肠埃希氏菌(E.coli)CMCC(B)44102金黄色葡萄球菌(Sta.aureus)CMCC(B)26003枯草芽孢杆菌（Bac.subtilis）CMCC(B)63501白色念珠菌(Can.albicans)CMCC(F)98001黑曲霉菌(Asp.niger)CMCC(F)98003营养肉汤培养基30-35℃18-24h改良马丁培养基20-25℃18-24h改良马丁斜面培养基20-25℃5-7天18微生物计数方法验证用菌株：USP29版菌株名称ATCC编号培养条件大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC873932+2.5℃金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC653832+2.5℃铜绿假单胞菌(Staphylococcusaureus)ATCC902732+2.5℃生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)ATCC1143732+2.5℃枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)ATCC663322+2.5℃白色年珠菌(Candidaalbicans)ATCC1023122+2.5℃黑曲霉菌(Candidaalbicans)ATCC1640422+2.5℃19计数方法验证步骤选定一个方法确定检测限设计验证方案20样品的选择：合格的样品-按照正常取样方法取样的样品-符合限度标准的样品21检测限：样品中细菌被检出的最低量。细菌≤100cfu/ml霉菌、酵母菌≤100cfu/ml22恢复试验的原则-消除样品的抑菌性-样品的处理方法和检验方法不应影响样品中微生物的生长23如何消抑菌活性-稀释法-中和法-离心法-薄膜过滤法-组合运用24计数方法验证（平板法）样品组：样品溶液（1/10）9.9ml104cfu/ml菌悬液0.1ml稀释剂对照组：蛋白胨稀释液9.9ml（阴性对照）104cfu/ml菌悬液0.1ml菌种组：104102（阳性对照）空白样品组：计数A计数B计数C计数D25结果判断依据：1、样品组和稀释剂对照组微生物计数结果吻合，表明：-添加的中和剂完全消除了样品的抑菌性。2、稀释剂对照组和菌种组微生物计数结果吻合，表明：-中和剂没有毒性，没有影响测试菌的生长。-测试方法和培养条件不影响测试菌的生长。3、空白样品组测试结果阴性，表明：-本次测试样品合格。-无菌操作正确。没有污染事件发生。26可以接受的标准—平板法1、重现性良好-三批不同批次的样品/产品-三次独立的试验2、验证数据合理有效（微生物的回收率）-阴性对照：无污染事件发生-样品组（回收率）：A=C±30%（偏差≤30%）3、样品的处理方法和检验方法与检验规程相符27计数方法的验证-各国药典结果判断标准USP：各试验菌的回收率均不低于70%。EP、BP、JP:各试验菌的回收率均不低于80%。2005版中国药典：各试验菌的回收率（包括供试品组和稀释剂对照组）均不低于70%。28不可以接受的标准：1、阴性对照：阴性对照(包括蛋白胨组和空白样品组)发生污染事件。菌落鉴别：-污染菌是测试菌：检验员无菌操作培训。-污染菌不是测试菌：偏差调查。2、阳性对照：样品组的试验数据与检测限不符。（微生物的回收率过高或过低）结论：样品组的试验结果无效。重新开始细菌的恢复试验直至与检测限相符。29不可以接受的标准：3、样品组：-三人三次的试验结果应该与检测限相符。-第一次的试验结果要能够被第二次和第三次的试验证实。-任何一次与检测限不符的结果都说明试验过程有缺陷，验证需重新进行。30优化更新步骤：消除抑菌活性。稀释样品时，应确认检测限（检验限度）低于或等于标准。不同的细菌，一个好的结果可以从不同的稀释度中检测出，最高的稀释度将被用于日常的监测中。31平板法优化更新方法：稀释样品：1/101/501/100增加培养基量延长培养时间添加抗活性剂32计数方法验证（薄膜过滤法）样品组：样品溶液（1/10）10ml过滤5x102cfu/ml菌悬液0.1ml蛋白胨对照组：蛋白胨稀释液10ml过滤（阴性对照）5x102cfu/ml菌悬液0.1ml菌种组：5x102cfu/ml菌悬液0.1ml过滤（阳性对照）空白样品组：过滤计数A计数B计数D计数C33可以接受的标准—薄膜过滤法1、重现性良好-三批不同批次的样品/产品-三次独立的试验2、验证数据合理有效（微生物的回收率）-阴性对照：没有污染事件发生。-样品组：B=A+30%（偏差≤30%）3、样品的处理方法和检验方法与检验规程相符34薄膜过滤法优化更新方法：增加冲洗量增大样品稀释倍数（1/50，1/100）延长培养时间添加抗活性剂（冲洗剂里加也可以）35微生物检验方法验证（二）控制菌检验方法验证36控制菌检验方法验证菌种选择原则样品的给药途径和类型决定了采用何种控制菌检查验证。37增菌培养基的确定增菌培养基的实际用量等同控制菌检查方法验证时的用量。验证的开始。38控制菌检验方法验证选定一个方法：CP或USP设定检测限：不得检出设计验证方案39控制菌检验方法验证（平板法）（以大肠杆菌为例）增菌（计数）样品组蛋