第9章 微生物的分类和鉴定

微生物的分类和鉴定第九章概念:微生物分类学：按微生物亲缘关系将其排成多种分类单位或分类群的科学。分类：将有关个体的大量资料经科学的归纳整理或反映生物进化规律的自然分类系统。鉴定：检测未知纯种微生物的多种性状特征，查找分类系统进行归类命名。命名：为新发现的微生物按国际命名法给出一个学名。一、微生物在生物界的地位1.五界系统：Whittaker（69年）提出五界学说2.三域系统：Woese提出三原界（域）学说古菌界（产甲烷菌，极端嗜盐菌，嗜酸嗜热菌）细菌界（蓝细菌，除古细菌以外许多原核生物）真核生物界（原生动物，真菌，动植物）•美国微生物学家沃斯(CarlWoese)采用分子生物学的方法做基因关系比较。1977年，他将rRNA分子片段做出基因序列分析(这种方法后来被普遍采纳)，然后重新绘制了演化树，将我们日常所熟知的千姿百态的细胞生物形式如动物、植物、真菌等都归于演化树上同一个分支———真核生物。•他正式提出了三域说，生物分类法中最高的类别不再是“界”，而是“域”，三个域分别是细菌域、古菌域和真核域。尽管还存在很多分歧，但三域系统是目前生物界被大多数人认可的主流分类系统。•在沃斯之前，人们普遍把动植物和真菌等之外的其他生物都全部归于原核生物，相对于真核生物，原核生物一般没有细胞内膜，没有细胞核膜，但依然有遗传物质，而真核生物不管是单细胞还是多细胞，细胞内都含有细胞核。•到上世纪90年代之前，演化树上只有两个分支：一个是真核生物，包括动物、植物、真菌和一些奇怪的生物形式，比如黏液菌；而没有被列入真核生物的，则被称为“其他所有一切生物”。随着基因分析技术的进步，上世纪90年代后，科学家发现，所谓的“其他所有一切生物”并不能笼统地归在一起，它事实上有两个完全不同的域：细菌和古菌。rRNA作为系统发育指示分子•所有生物的rRNA在功能与进化上都具有同源性•rRNA是古老的分子，在整体结构上极端保守•rRNA的核苷酸序列也具有保守性•rRNA在细胞中的含量大•rRNA可提供足够的序列信息进行统计分析比较•原核生物核糖体rRNA含有3种类型：23S，16S，5srRNA．它们分别含有约2900．1540和120个碱基。•rDNA或rRNA序列既具有保守性．又具有高变性，是目前细菌分类和鉴定经常使用的一种检测方法。16srRNArDNA（核糖体RNA）是目前细菌系统分类研究中最有用和最常用的分子钟，其种类少（5s,16s,23s)，含量大（约占细菌RNA含量的80%），分子大小适中，存在于所有的生物中，特别是在结构与功能上具有高度的保守性。16srRNA为原核生物核糖体中一种核糖体RNA，其大小约为1.5kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能通过测序获得其序列，从而通过对其序列的分析，判定不同菌属、菌种间的遗传关系的远近。研究方法环境样品获得总DNA16SrDNAPCRDGGE同源性比对,绘制进化树测定序列16SrDNAPCR,T载体连接克隆割胶获得DNA片段目前．16SrDNA序列分析方法在乳酸菌分类鉴定运用比较多．Choi用16SrDNA序列分析和DNA杂交技术研究了泡菜中乳酸菌的菌群变化。在泡菜5d的发酵过程中随机分离出120株乳酸菌．结果发现在发酵的前中期，柠檬明串珠菌(L．citreum)是优势种，然而在发酵后期主要为清酒乳杆菌(L．sake)或弯曲乳杆菌(L．curvatus)以及短乳杆菌。乌日娜等采用16SrDNA测序和同源性分析的方法．以大于98％的同源性将L．casei．zhang和ZL12-1分别鉴定为L．caseisubsp．casei和L．gallinarum。二、微生物的命名法（一）分类单位：•界、门、纲、目、科、属、种•种是最基本的分类单位，•每一分类单位之后可有亚门、亚纲、亚目、亚科.....1.种：种是一个基本分类单位，是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近，与同属内其他种有明显差别的菌株的总称。这里的种仅仅是指种的模式种或典型种2．新种：发表文章时，确定为新种，在学名后加sp.nov(speciesnova)或nov.sp。指某一明显而稳定的特征与模式种不同的种，有时称小种。如：E.colik12模式种（野生型）是不需要特殊氨基酸的，而实验室变异后，可从k12获得某氨基酸的缺陷型，此即称为E.colik12的亚种或小种。3.亚种：（subspecies,subsp,ssp）：4.型（form）:同种微生物的各种类型。如：血清型、抗原型5．菌株（strain）:又称品系：一种微生物的不同来源的纯培养物。（二）命名1.双名法：林奈创立。此为国际命名法规，即：每一微生物的学名都依属与种而命名属名+种名+（首次定名人）+现定名人+定名年份属名：拉丁文的名词或用作名词的形容词，字首大写，表示微生物的主要特点，由微生物构造，形状或由科学家命名种名：为拉丁文形容词，为微生物次要特征，字首小写，为微生物色素、形状、来源或科学家姓名等。如：Escherichiacoli当文章中前面已出现学名时，后面可将属名缩写成一至三个字母。如:E.coli2．三名法：种名后面加亚种，亚种可用正体如：Staphylococcusaureussubsp3．属名+sp(ssp)，表示种名未定。三、分类依据（一）形态特征：大小，排列，分化，结构，染色等（二）培养特征：营养要求，生长的物理环境（酸碱度，温湿度），菌落，菌苔，液体培养特征。（三）代谢特征：微生物生命活动的方式。如：I.M.Vit（四）化学组成特征：细胞主要特征性化学成分的鉴定如：细胞壁成分、细胞内含物（五）抗原特征：抗原成为化学组成的一个特殊方面，微生物具有许多不同类型的抗原。（六）生态特征：与其他生物的关系、自然界的分布、致病性等•乳酸菌(1acticacidbacteria)是可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称。最新的研究资料将乳酸菌分为23个主要的属，220多个种，如乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidbacterium)、链球菌属(Streptococcus)、明串珠菌属(Leuconstoc)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、肉食杆菌属(Carnobacterium)和片球菌属•(Pediococcus)等。现代分类依据还需补充：（七）细胞壁成分：（八）GC含量某一特定种的DNA碱基组成是恒定的。GC含量以碱基全部克分子中G和C的摩尔百分数表示：G+CG+C+A+T×100%=（G+C）mol%•种内各株可差2.5~4.0%;若相差2%为同种。•不同种相差5%以上；若相差10%为不同属。分类依据所得数值范围从23~75•一般认为G+C％相差I％，DNA碱基序列的共同区域就大约减少9％，G+C％差异在l0％以上，DNA碱基序列的共同区域就很少了，因此DNA．DNA杂交最适合细菌种水平的研究。通常在虽适复性条件下，DNA同源性在70％以上属于种的水平。方法：解链温度法原理：•一定pH和离子强度下加热DNA，氢键打开；•在260nm处，随着温度增加，双链变单链导致紫外吸收增加，引起增色效应。增色效应一半时的温度（热变性温度，Tm）可反映出不同的DNA中的（G+C）%值。Tm=69.3+0.41*(G+C)%（九）DNA杂交法：原理：根据DNA解链的可逆性和碱基配对的专一性。若同源性70%以上为种的水平，20%以上可能是属的水平。(十）16SrRNA•在30多亿年生物进化的漫长历史中始终执行着相同的生理功能，所以碱基顺序变化很少，所以称其为保守结构。选用16srDNA做分析标记的原因•rRNA是细菌分类学中最常用的分子钟，种类少，含量约占细菌rRNA含量的80%，分子大小适中，存在于所有的生物中，在结构和功能上具有高度的保守性，在进化上具有良好的时钟性质，有细菌化石之称。•16srRNA是原核生物核糖体中一种核糖体RNA，约1.5kb左右，既能体现菌属的差异，又能利用测序方法较容易的得到其序列。•16srRNA的方法更适于确定属及属以上分类单位的亲缘关系。不仅能检测常规培养菌，还可检测极难或不能培养的菌细菌16srRNA可变区结构图DGGE-system•DGGE胶是在6%聚丙烯酰胺胶中添加线性梯度的变性剂，变性剂的浓度由上到下，从低到高成线性梯度。在一定温度，统一变性剂浓度下，序列不同的产物其部分解链程度也不同，而产物解链程度又直接影响其电泳迁移率，使长度相同序列组成不同的产物在凝胶上分离开来。极地不可培养细菌多样性研究2005年止，利用不可培养细菌研究方法，已经从海冰细菌中发现了8个新属和29个新种人类肠道的菌群多样性(Bacterialdiversity)•婴儿肠道菌群多样性研究•肥胖病肠道菌群变化研究•健康状况影响肠道菌群变化婴儿肠道菌群多样性研究•研究新生儿粪便菌群，可以了解不同喂养方式对其肠道菌群发育的影响。发现母乳喂养前肠道菌群以梭状芽胞杆菌、链球菌和克雷伯菌为主;开奶后母乳喂养儿以双歧杆菌为主,奶粉喂养肠道菌群显示多态性,有双歧杆菌、梭状芽胞杆菌、链球菌、大肠埃希菌、克雷伯菌、沙雷菌以及不经培养细菌。肥胖病肠道菌群变化研究•RuthE.Ley等研究分析了肥胖老鼠ob_obmice盲肠中的5088种细菌的16SrRNA基因序列，发现厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌纲(Bacteroidetes)的比例有明显变化健康状况影响肠道菌群变化•themicrobeson20humanvaginalepitheliaofhealthywomenhavebeenidentifiedandquantitated•TheLactobacilluscontentonthese20healthyvaginalepitheliawashighlyvariable,rangingfrom0%to100%.•foursubjects,Lactobacilluswas(virtually)theonlybacteriumdetected•eightsubjectshadnoLactobacillus.Instead,Bifidobacterium,Gardnerella,Prevotella,Pseudomonas,orStreptococcuspredominated•16SrRNA／16SrDNA相对分子质量适中，其基因核苷酸序列具有高度保守性。但它的保守性又是相对的，在保守区之间存在9～10个变异区，不同科、属、种间都具有一定的变异，通过比较各类生物的16SrRNA／16SrDNA基因序列差异，可以计算它们之间的进化距离，也可以利用恒定区序列设计引物，将16SrRNA／16SrDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定•。根据Matsuki的研究，凡是16SrDNA可变区序列的同源性大于97，便可认为是同一种四、常用分类方法：1.经典分类法：将形态、结构特征作为初步特征，再比较生理、生化特征，采用双歧法整理结果，进行分类。2.数值分类法：根据数量特征进行分类，可根据50~60个或100以上，用电脑进行计算统计。3.遗传分类法：主要依据GC含量及DNA杂交试样为依据