酶类药物的分析06-12-04(生科院)

1氨基酸定量（一）茚三酮法（二）三硝基苯磺酸法（三）铜复合物紫外吸收法（四）甲醛滴定法（五）非水溶液滴定法（六）双波长分光光度法（七）导数分光光度法（八）HPLC法2蛋白质分子量测定超离心沉降速度离心沉降平衡凝胶过滤柱层析SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳3蛋白质定量法凯氏定氮法双缩脲法福林酚法紫外光吸收法考马斯亮蓝G-250法BCA4蛋白质组成氨基酸分析氨基酸自动分析仪测定原理蛋白水解法：1、盐酸水解法2、磺酸水解法3、碱水解法4、酶水解法5酶类药物的分析第一节概述第二节酶类药物的鉴别与检查第三节酶活力测定方法第四节酶活力测定方法设计第五节典型酶类药物的检测6第一节概述在生物体内，酶能降低生化反应活化能，加快可逆反应的进行速度，使之尽快达到平衡。一、酶的特性二、酶的分类三、酶的化学组成四、酶的催化反应机制五、酶催化反应动力学7一、酶的特性1．酶是高效催化剂。2．酶对底物的结构具有严格的选择性。（1）相对专一性：（2）绝对专一性:（3）立体异构专一性:3．酶催化反应的反应条件温和。4．酶的催化活性在生物体内受多种因素的调节。8二、酶的分类氧化还原酶转移酶水解酶裂合酶异构酶合成酶（或称连接酶）9三、酶的化学组成分为简单酶和结合酶两大类。结合酶类中除含有蛋白外，还含有某种热稳定的非蛋白质的小分子物质，二者结合起来，称为“全酶”，才呈现生物催化活性。结合酶=酶蛋白+辅助因子10四、酶的催化反应机制1．酶-底物复合物的形成在酶促反应中，反应底物首先与酶分子上活性部位结合，形成酶-底物复合物，降低反应的活性能，使酶促反应顺利进行。2．酶-底物复合物加速反应速率的原因（1）定向作用与底物浓缩（2）酶使底物分子变形（3）酸碱催化（4）共价催化。11五、酶催化反应动力学酶的活力单位酶活性单位（U）是酶活性高低的一种量度，用U/g或U/ml表示。酶活力单位定义：在规定的条件下，每分钟能转化1μmol底物所需要的酶量，称一个酶的活力单位。酶的比活力每毫克酶蛋白所含酶活力，U/mg。12Michaelis-Menten快速平衡学说底物浓度的增加，反应速度上升呈双曲线。在低底物浓度时，反应速度呈直线上升，表现为一级反应。在高浓度时，反应速度达到一个极限值，呈现零级反应。13米氏方程酶反应动力学方程式：V——反应初速度Vm——最大反应速度Ks—米氏常数，Ks=K－1/K1，Ks为ES的解离常数，表示酶与底物的亲和力。Ks为反应速度V是最大反应速度Vm一半时所需底物浓度，即V=1/2Vm时，Ks=[S]。14Briggs-Haldane稳态学说ES的形成速度与ES的解离速度相等，达到动态平衡，即“稳态”，反应方程式：Km取代了Ks，当V=1/2Vm时，Km=[S]。Km也可表示为底物与酶的亲和力。15第二节酶类药物的鉴别与检查鉴别方法常用蛋白质鉴别方法，如在碱性条件下的双缩脲反应。专用于酶的鉴别方法：酶活性试验：与特异性底物反应（胰蛋白酶）。沉淀试验：胃蛋白酶动物试验：透明质酸酶水解粘多糖。16酶类药物的检查酶类药物是生化产品和微生物发酵产品，在生产过程中可能带入微量的脂肪类物质、其他的酶类和大分子杂质，影响酶质量，需有含量限度。17酶类药物的检查（一）脂肪含量限度检查检查方法，乙醚浸提，干燥，精密称定，脂肪不得过规定的含量。（二）其他酶类含量限度检查胰蛋白酶、糜蛋白酶均是从牛、猪的胰脏中提取的蛋白分解酶。提取胰蛋白酶时又易带入微量的糜蛋白酶。（三）大分子活性物质含量限度检查18胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量每2500U胰蛋白酶中不得多于50U的糜蛋白酶。糜蛋白酶专属水解芳香氨基酸（L-酪氨酸、L-苯丙氨酸）的羧基形成的肽键、酰胺键和酯键。用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯（N-Acetyl-L-TyrosineEthylester，ATEE）作底物，通过分光光度法测定此酶对底物的水解速率来检查该酶的含量限度。19第三节酶活力测定方法固定时间法连续监测法固定浓度法20一、固定时间法在适宜的条件下，使酶和底物共同保温一定时间，然后测定产物生成的量或底物消耗的量从而间接推算出酶的含量（或活力）。[E]表示酶浓度，[P]为反应产物浓度，t表示酶作用时间，K为常数。21注意事项缺点：无法了解整个反应过程是否都是零级反应。注意事项：1、底物饱和2、时间22二、连续监测法在酶反应过程中，连续记录不同时间的底物消耗量或产物生成量。（一）、需NAD+或NADP+作指示的连续监测法（二）、不需NAD+或NADP+作指示的连续监测法23（一）、需NAD+或NADP+作指示的连续监测法：还原型辅酶（NADH和NADPH）在340nm处有紫外吸收，氧化型辅酶（NAD+和NADP+）在340nm处无紫外吸收.利用340nm处每分钟吸收度升高或降低的速率与酶活性成正比的关系，推算出酶的活力单位。包括：直接测定法偶联法三联酶活测定24直接测定法大多数需NADH（NADPH）参加的脱氢酶，可利用紫外分光光度法直接测定反应体系在340nm处吸收度的变化，计算酶活力单位。丙酮酸＋NADH＋H+乳酸＋NAD+340nm处吸收度降低的速率与NADH的氧化速率成正比，与LDH的活力成正比。25偶联法此类酶催化反应不需NAD+或NADP+，但当与需NAD+或NADP+的脱氢酶反应偶联以后，能用紫外分光光度法测定.由脱氢酶引起的反应为指示反应，脱氢酶是指示酶，指示酶活力要比测定酶活力至少大100倍。例如：谷草转氨酶的测定：26三联酶活测定引入一个辅助酶反应，将被测酶反应系统与指示酶反应系统联系起来，组成一个“三合一”酶反应系统，使底物转化率、辅助酶反应和NADH（NADPH）氧化速率之间成正比函数关系，辅助酶和指示酶的活力必须大大超过测定酶活力。例如：磷酸肌酸+ADP肌酸＋ATP……(1)葡萄糖＋ATPG-6-P＋ADP……(2)G-6-P+NADP+葡萄糖酸-6-磷酸＋NADPH＋H+…(3)(1)被测反应，(2)辅助反应，HK（己糖激酶）辅助酶，(3)指示反应，G-6-PDH（6—磷酸葡萄糖脱氢酶）指示酶。27（二）不需NAD+或NADP+指示的连续监测法：酶底物大多是人工合成的“色素元”，其本身无色，经酶作用后释放出有色的反应产物。根据反应过程中吸收度增高速率，算出酶活力单位。例如：磷酸对硝基苯酚酯对硝基苯酚28三、固定浓度法根据酶催化反应，使反应产物达到额定的浓度时其反应时间与酶浓度成反比的原理进行设计的。[P]=K[E]t测定时间.以所需时间的倒数（1/t）对酶浓度作图即可制备标准曲线。优点：1、记录时间。2、准确29第四节酶活性测定方法的设计一、影响因素二、底物与产物的测定方法三、测定条件的选择30一、影响因素1、底物2、pH3、温度4、酶浓度5、空白和对照31底物酶可以同时作用多个底物。以Km最小者作为此酶的生理底物。从底物性质看，选用的底物最好在物理化学性质上与产物不同，利于测定。从底物浓度看，为不使酶反应受到它的控制，反应系统应使用足够高的底物浓度。32胰凝乳蛋白酶几种底物的Km底物Km（mmol/L）N－苯甲酰酪氨酰胺2.5N－甲酰酪氨酰胺12.0N－乙酰酪氨酰胺32.0甘氨酰酪氨酰胺122.033底物浓度对酶反应速度的影响[S]/KmV/Vmax0.010.99％0.11.0％150％1091％10099％34pH酶活力测定选用缓冲体系。不同缓冲液所受影响不同。磷酸盐所受影响较小，而Tris则受影响较大。酶溶液用量与底物溶液比例不超过10％为宜。35温度温度变化1℃，反应速度可能相差10％以上，控制在±0.1℃。反应温度一般为25℃，此时酶不易灭活，Km较小，可以使用较低的底物浓度。有些酶在37℃不稳定。36酶浓度酶样要充分稀释。取3个不同酶量测得的产物量和酶浓度之间为正比关系，这样的酶浓度范围就是适当的。37空白和对照空白：指杂质反应或自发反应引起的变化量，代表未知因素的影响。分为完全空白（如测定时要终止反应，则空白可先加终止反应试剂再加酶）。酶空白底物空白38二、底物与产物的测定方法（酶反应的检测方法）1、化学方法：用化学法测定其中某一底物或产物的变化值。2、分光光度法：常用的有比色法和紫外分光光度法。3、荧光测定法：简单、灵敏、快速。4、电化学分析法（1）离子选择性电极分析法（2）微电流法5、其他方法如测定气体的测压法，测定产物旋光度变化值的旋光测定法。39三、测定条件的选择1、单因素选择2、正交设计——多因素选择401、单因素选择－比色法测溶菌酶活性以染料艳红K-2BP标记的M·Lysodeikticus为底物，分解后产生游离染色碎片（产物）离心除去未分解底物，上清液比色吸收度为溶菌酶活力的函数。41测定条件选择－SpH（1）酶反应底物浓度曲线以染料标记的M·Lysodeikticus为底物，酶含量为20μg时，1%底物浓度已接近使酶饱和。（2）酶反应PH曲线磷酸缓冲液和柠檬酸—磷酸缓冲液。不同组分的缓冲液，其最适PH稍有不同，选用pH6.5磷酸缓冲液。42测定条件选择－离子强度、反应时间及[E]（3）离子强度对酶反应的影响离子强度在0.3mol/L以上为宜，选用0.5mol/L。（4）酶反应过程曲线(反应时间)和酶浓度曲线酶量为20μg时，反应在30分钟以内，吸收度与反应时间有良好的线性关系，测定系统选用15分钟。酶量在50μg之内，吸收度与酶浓度具有线性关系。43测定条件1%染色菌体缓冲液1ml37℃水浴保温约5分钟加酶试样0.5ml准确反应15分钟加入酸/乳化剂混合液2ml，终止反应，反应液经离心，上清液于540nm比色，所得吸收度从酶浓度标准曲线即可查出试样中溶菌酶含量。44二、正交设计－多因素选择正交试验设计（Orthogonalexperimentaldesign）是一种高效的利用正交表来安排多因素多水平设计试验的方法。通过巧妙的安排和分组，用较少的试验次数，就能分析各因素的作用大小，找出最佳的试验条件。利用各因素所对应指标的极差R及平均极差D作出判断。45正交试验优选中性蛋白酶活力测定条件中性蛋白酶是一种蛋白水解酶，它的活力测定主要是以酪蛋白为底物，在适宜的条件下，中性蛋白酶催化底物水解，水解产物与福林试剂在碱性情况下反应生成有色物质，于680nm处测定吸收值，以酪氨酸为标准对照品计算其活力。中性蛋白酶的催化作用受缓冲液的pH值、底物浓度、反应时间及酶浓度等因素的影响。供试品：0.01%的中性蛋白酶溶液。底物：酪蛋白46实验方案实验取四个因素：PH值、底物浓度、反应时间、酶浓度。每个因素选三水平、属于多因素多水平，为此选用L9（43）正交表进行实验。47正交试验表实验号A缓冲液pH值B底物浓度(%)C反应时间(min)D酶浓度（U/ml）11111212223133342123522316231273132832139332148正交实验安排表49正交实验安排表50各因素试验值计算结果平均极差越大，对应的因素影响越大。缓冲液PH值7.2，底物浓度0.5%，酶浓度用100U/ml为最佳反应条件。反应时间为10，20，30min，对OD值无显著影响。51各因素试验值的方差分析结论：PH值（A）、底物浓度（B）、酶浓度（D）为非常显著因子；反应时间（C）为非显著因子。52第五节酶类药物的检测肽键水解酶脂键水解酶糖苷键水解酶其它（超氧化物歧化酶）53一、肽键水解酶1、胰蛋白酶2、弹性蛋白酶3、尿激酶541、胰蛋白酶—比色法胰蛋白酶：由牛、羊、猪等动物的胰脏中提取的一种蛋白水解酶。牛胰蛋白酶：233个氨基酸，分子量24000，等电点10.1。猪胰蛋白酶：214个氨基