重楼属药用植物DNA 条形码鉴定研究

·376·药学学报ActaPharmaceuticaSinica2010,45(3):376-382重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究朱英杰1,2,陈士林2,姚辉2*,谭睿1*,宋经元2,罗焜3,鲁静4(1.西南交通大学生命科学与工程学院,四川成都610031;2.中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所,北京100193;3.湖北中医学院药学院,湖北武汉430061;4.中国药品生物制品检定所,北京100050)摘要:为评价DNA条形码候选序列对重楼属药用植物的鉴定作用,探讨重楼属药用植物鉴定新方法,本研究对重楼属11个物种17份样品的psbA-trnH、rpoB、rpoC1、rbcL、matK和核ITS2序列进行PCR扩增和测序,比较各序列扩增和测序效率、种内和种间变异,进行barcodinggap分析,采用BLAST1和NearestDistance方法评价不同序列的鉴定能力。结果显示,ITS2序列在所研究的重楼属药用植物中的扩增和测序效率均为100%,其种内种间变异、barcodinggap与其他DNA条形码候选序列相比具有明显的优势,ITS2序列在重楼属中的鉴定成功率达到100%,而生物条形码协会(CBOL)植物工作组推荐的matK和rbcL序列的鉴定成功率分别为52.9%和5.9%,二者联合鉴定能力没有提高,对于ITS2序列扩大至29个物种67份样品依然具有100%的鉴定成功率。实验结果表明,ITS2序列能够准确鉴定重楼属药用植物,可以作为潜在的药用植物通用条形码序列。关键词:重楼属;DNA条形码;ITS2;药用植物;鉴定中图分类号:R931.5文献标识码:A文章编号:0513-4870(2010)03-0376-07DNAbarcodingthemedicinalplantsofthegenusParisZHUYing-jie1,2,CHENShi-lin2,YAOHui2*,TANRui1*,SONGJing-yuan2,LUOKun3,LUJing4(1.SchoolofBioscienceandEngineering,SouthwestJiaotongUniversity,Chengdu610031,China;2.InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100193,China;3.SchoolofPharmacy,HubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan430061,China;4.NationalInstitutefortheControlofPharmaceuticalandBiologicalProducts,Beijing100050,China)Abstract:DNAbarcodingisatechniqueinwhichspeciesidentificationanddiscoveryareperformedbyusingshortandstandardfragmentsofDNAsequences.Inthisstudy,elevenspeciesofParis,includingsevenvarieties,weresampled.Fivechloroplastsequences,psbA-trnH,rpoB,rpoC1,rbcL,matK,andonenuclearmarker,thesecondinternaltranscribedspacer(ITS2)ofribosomalDNA,wereamplifiedandsequenced.ThePCRamplificationandsequencingefficiency,intra-andinter-specificdivergenceandbarcodinggapwereusedtoevaluatedifferentloci,andtheidentificationefficiencywasassessedusingBLAST1andNearestDistancemethods.TheITS2sequencesinthestudiedsamplesofPariswereamplifiedandsequencedsuccessfullyusingprimersdesignedbyourgroup,whilematKshowedlowlevelintheamplificationandpsbA-trnHwasdifficultforsequencingbecauseofover800bpandpoly(A)structure.Analysisoftheintra-andinter-specificdivergenceandbarcodinggapshowedITS2wassuperiortootherloci.TheITS2showedamuchhigherpercentageofsuccess(100%)inidentificationthanotherfiveloci,noneofwhichindicatedmorethan50%exceptmatK(52.9%).The2-locuscombinationofrbcL+matKdidn’timproveabilityofauthentication.Inaddition,therateofsuccessfulidentificationwithITS2kept100%whenthesampleswereexpandedto67samplesof29species.Inconclusion,ITS2canbeusedtocorrectlyidentifymedicinalplantsofParis,anditwillbeapotentialDNAbarcodeforidentifyingmedicinalplantsofothertaxa.收稿日期:2009-11-17.基金项目:国际科技合作项目(2007DFA30990);卫生行业科研专项(200802043).*通讯作者Tel:86-10-62899727,Fax:[phone],E-mail:[e-mail],[e-mail]朱英杰等:重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究·377·Keywords:Paris;DNAbarcoding;ITS2;medicinalplant;identification重楼属(ParisL.)是百合科多年生草本植物,《中国植物志》英文版[1]中记载重楼属植物全世界约有39个物种(含19个变种),主要分布在欧亚大陆的热带至温带地区。该属植物在国内多做药用,其中滇重楼[Parispolyphyllavar.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.]及华重楼[P.polyphyllavar.chinensis(Franch.)Hara.]收载于2005年版《中国药典》,是云南白药等多种中药的重要原料之一。然而重楼植物分类复杂,由于不同类群的特征性状交叉重叠,各类型界限模糊不清,给重楼药用植物鉴定带来困难[2]。近年来,随着对重楼需求量的增大,野生重楼资源急剧减少,商品药材品种混乱,药材品质不一[3],寻找鉴定重楼药材的有效方法迫在眉睫。有关重楼植物鉴定,已有形态学、细胞学(包括核型和染色体多态性)和RAPD、AFLP等DNA分子标记方面[4,5]的研究,这些研究都为重楼属药用植物的鉴定提供了依据。而DNA条形码技术直接利用DNA序列进行物种的鉴定,具有独一无二的可重复性,为药用植物鉴定带来了新的机遇[6]。自加拿大动物学家PaulHebert[7]于2003年首次提出DNA条形码(DNAbarcoding)概念以来,DNA条形码研究已成为近年来生物分类学研究的热点和前沿[8]。DNA条形码技术是利用基因组中一段通用的标准短序列来进行物种鉴定的分子诊断新技术[6],通过建立生物DNA条形码系统能够实现快速、准确和自动化的物种鉴定。截止目前,研究者们已经提出了10多条植物候选DNA条形码序列[9],并在不同的类群中对各条形码的鉴定能力进行了考察,CBOL植物工作组提出使用rbcL+matK复合序列作为植物界的通用条形码序列[10],但由于扩增效率、鉴定成功率等问题,其在植物界的通用性仍受到质疑。ITS2是真核生物rDNA上的一段顺反子,位于5.8S和26SrRNA之间,它在物种间具有显著地差异,因此,被广泛用于物种分类及系统进化研究[11]。ITS2序列具有适合扩增和测序的长度,有利于对发生降解的样品进行扩增[12]。ITS2片段在物种水平的变异较快,有更多的突变位点以区分不同的物种,因此,在DNA条形码鉴定物种方面具有潜在的研究价值。本研究应用近年来提出的植物DNA条形码候选序列psbA-trnH、rpoB、rpoC1、rbcL、matK[13−15],以及在系统进化中应用广泛的核ITS2序列[16]对重楼属进行研究,考查不同DNA条形码候选序列在重楼属药用植物鉴定中的能力,以期建立重楼属药用植物数字鉴定方法。材料与方法材料重楼属实验材料11个物种(含7个变种)17份样品采自云南、四川等地,经中国药品生物制品检定所鲁静研究员和中国医学科学院药用植物研究所林余霖副研究员鉴定,凭证标本保存于中国药品生物制品检定所和中国医学科学院药用植物研究所。实验材料详见表1,GenBank登录号为GU178884-GU178972。Table1SamplesfortestingpotentialbarcodesSamplesnameSamplinglocationVouchernumberParisvietnamensisYunnanSimaoPS1642MT01P.verticillataLiaoningDalianPS1635MT01P.polyphyllavar.yunnanensisYunnanWudingPS1637MT05P.polyphyllavar.yunnanensisYunnanWudingPS1637MT04P.polyphyllavar.yunnanensisYunnanWudingPS1637MT01P.polyphyllavar.chinensisYunnanWudingPS0051MT03P.polyphyllavar.chinensisShanxiQinlingPS0051MT02P.polyphyllavar.chinensisSichuanHongyaPS0051MT26P.polyphyllavar.stenophyllaSichuanHongyaPS1644MT21P.polyphyllavar.stenophyllaYunnanWudingPS1644MT01P.fargesiivar.fargesiiYunnanWudingPS1643MT01P.polyphyllavar.YunnanWudingPS1636MT01pseudothibeticaP.polyphyllavar.YunnanWudingPS1636MT02pseudothibeticaP.luquanensisYunnanWudingPS1641MT01P.marmorataYunnanWudingPS1638MT01P.delavayivar.delavayiYunnanWudingPS1640MT01P.polyphyllavar.polyphyllaSichuanHongyaPS1651MT01样品DNA的提取、PCR扩增和测序药材根茎使用70%乙醇擦洗表面后研磨,无水乙醇浸泡5min后脱水,植物叶片采用硅胶进行干燥,取样10mg,用DNA提取研磨仪(RetschMM400,Germany)研磨1min(