钠钙交换体基因稳定转染及药物筛选细胞模型的建立

史上最快最全的网络文档批量下载批量上传，尽在：=9176907081钠钙交换体基因稳定转染及药物筛选细胞模型的建立龙雁，袁辉，王晓良*中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所先农坛街1号，北京，100050摘要：目的构建三种不同亚型的CHO-NCX稳定转染细胞株，以便筛选可能的钠钙交换体（NCX）调节剂。方法采用脂质体法将NCX目的基因稳定导入CHO细胞中，检测稳定转染细胞株中NCX的蛋白表达和电流大小，并观察温度和NCX抑制剂KB-R7943对电流的影响。结果Westernblot结果显示与CHO-pcDNA3.1空白细胞相比，CHO-NCX稳定转染细胞株中NCX蛋白的表达量显著升高；电生理结果提示CHO-NCX稳定转染细胞株中NCX电流远大于CHO-pcDNA3.1空白细胞；温度从22℃升高到35℃时，NCX电流显著增大；NCX抑制剂KB-R7943对INCX具有显著抑制作用。结论本试验成功的建立了特异性表达NCX1.1，NCX1.4，NCX1.5三种亚型的细胞模型，为脑缺血等疾病的研究提供了良好的药物筛选平台。关键词：NCX1.1；NCX1.4；NCX1.5；NCX抑制剂KB-R7943；膜片钳EstablishmentandEvalutionofCellModelTargetedatSodium-CalciumExchangerLongYan,YuanHui,WangXiaoliang(InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)ABSTRAT:OBJECTIVETodeveloppotentialNCXmodulatorwith3differentkindsofCHO-NCXcellswhichstablyexpressedNCXproteins.METHODSTheNCXgeneswereligatedwithpcDNA3.1+vectorandthenstablyintroducedintoCHOcellsbyliposome.UsingwesternblotandpatchclamptechniquetomeasuretheexpressionlevelsofNCXproteinsandNCXcurrents,afterwhichtoobservethemagnitudeofNCXcurrentswhentemperaturechangedandNCXinhibitorutilized.RESULTSComparedwithblankCHO-pcDNA3.1cells,theproteinamountsofstablytransfectedCHO-NCXcellsweresignificantlyincreased;thecurrentsofCHO-NCXcellsweremuchhigherthanthatofblankCHO-pcDNA3.1cells.Whentemperaturechangedfrom22℃to35℃,thecurrentsofCHO-NCXcellsup-regulatednotably,afterNCXinhibitorKB-R7943added,thecurrentsofCHO-NCXcellsdecreasedsignificantly.CONCLUSIONOurstudysuccessfullyconstructedacellmodelwhichexpressedaspecifickindofNCXisoforminCHOcells,whichprovidedausefultooltosearchnewdrugsofcerebralischemiatargetedatNCX.KEYWORDS:NCX1.1;NCX1.4;NCX1.5;NCXinhibitorKB-R7943;patchclamp作者简介：龙雁，女，博士研究生Tel：(010)[e-mail]钠钙交换体（NCX）是细胞膜上具有9个跨膜片段的一种双向转运体，根据细胞膜内外离子浓度梯度和膜电位的不同，NCX可以通过正向转运（Ca2+外流）或者反向转运（Ca2+内流）两种转运方式将Na+和Ca2+以3：1或者4：1的比例进行交换，从而维持细胞内Ca2+的稳定[1-3]。生理状态下，NCX主要利用细胞内外的Na+浓度梯度排出细胞中的Ca2+[4]，而在病理状态下，当细胞内Na+浓度升高时，NCX反向转运可以导致细胞内钙超载。近年来越来越多的研究表明NCX与脑缺血关系非常密切，但结论并不一致。有的研究者认为抑制NCX反向转运具有脑保护作用，而有的研究者却认为激活NCX的反向转运可以有效保护神经元[5]。此外，在低氧缺氧，脊髓损伤后的白质退行性病变，大脑损伤，视神经损伤，神经元调亡，衰老和阿尔兹海默病等相关疾病中，也有研究提示NCX可能发挥了重要的作用[6]。由于NCX具有重要的生理和病理学意义，自1968年Baker等人首次报道NCX的存在以来，一直是人们研究的热点。内容包括NCX的分布表达，活性调节，结构-功能关系以及在疾病过程中的作用等方面，研究手段包括RNA/蛋白水平定位，反义寡核苷酸/RNAi技术，制备基因敲除小鼠等。但研究结果发现反义寡核苷酸技术仅在体外可行，体内无效[7-9]，NCX1基因敲除小鼠在胚胎状态则已死亡[10]。因此，在这种情况下，急需研发一种选择性的NCX抑制剂以便观察NCX的作用。比较遗憾的是，至今为止还没有找到具有高特异性的化合物，也没有以NCX为靶点的临床药物上市。哺乳动物细胞中共有三种NCX亚型，NCX1在体内广泛存在，主要位于脑，心脏，肾脏等部位，在上述组织中，已检测到7种NCX1剪切产物，其中，NCX1.1主要位于心脏，NCX1.4，NCX1.5和NCX1.6主要分布在大脑，其余三种剪切产物。NCX2和NCX3仅在脑和骨骼肌中有表达，其中NCX3有3种剪切产物，而至今未检测到NCX2的选择性剪切产物[6]。此外，各种NCX亚型具有不同的分布特性，这提示不同的NCX亚型在脑缺血中的作用可能不同。同时，NCX还具有双向转运特性，这也增加了以NCX为靶点进行药物开发的难度。因此，在筛选以NCX为靶点的化合物时，必需观察化合物对不同的选择性剪切产物及其转运方式的影响。基于上述原因，本试验将NCX1.1，NCX1.4，NCX1.5三种质粒通过脂质体转染的方法稳定导入CHO细胞中，建立特异性表达NCX1.1，NCX1.4，NCX1.5三种亚型的细胞模型，并观察了温度与NCX抑制剂KB-R7943对INCX的影响，希望通过该细胞膜型筛选化合物以便开发新型的NCX调节剂。结果ABFig1.StructuresofpcDNA3.1+andpcDNA3.1+/NCXplasmids.(A)StructureofblankpcDNA3.1+plasmid.(B)StructureofpcDNA3.1+/NCXplasmidsafterdoubledigestionandsubsequentinsertionofNCXgenestoHindⅢandBamHⅠsite.图1.pcDNA3.1+和pcDNA3.1+/NCX质粒结构图。(A)为pcDNA3.1+质粒结构，(B)为pcDNA3.1+/NCX质粒结构，用HindⅢ和BamHⅠ双酶切，再插入三种不同的NCX目的基因。1、质粒鉴定结果：（1）酶切：将pcDNA3.1+质粒，NCX1.1，NCX1.4以及NCX1.5质粒用BamHI和HindⅢ分别进行酶切，酶切产物用1%的琼脂糖电泳进行初步鉴定。Fig2.AnalysisofBamHⅠandHindⅢtreatedpcDNA3.1+plasmidon1%ethidiumbromide-stainedagarosegel.Line1:singledigestionproductofpcDNA3.1+vectorbyHindⅢ;Line2:singledigestionproductofpcDNA3.1+vectorbyBamHⅠ;Line3:doubledigestionproductofpcDNA3.1+vectorbyBamHⅠandHindⅢ;Line4:untreatedpcDNA3.1+vector;Line5:Marker;图2.应用BamHⅠ和HindⅢ双酶切法对pcDNA3.1+载体进行分析鉴定。条带1：HindⅢ单酶切；条带2：BamHⅠ单酶切；条带3：BamHⅠ和HindⅢ双酶切；条带4：未处理的pcDNA3.1+载体；条带5：分子量Marker。如图所示，pcDNA3.1+质粒载体（5428bp）中分别包含一个限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点，单酶切后生成约5.4kb的单链，符合理论值。而pcDNA3.1+载体上的BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点相隔仅18bp，其中18bp12345215000bp210000bp27500bp25000bp22500bp21000bp片段过小未能显示，另一片段大小约5.4kb。完整的pcDNA3.1+质粒载体包含多种构像，从而出现多条条带。Fig3.AnalysisofBamHⅠandHindⅢtreatedratNCX1.1plasmidon1%ethidiumbromide-stainedagarosegel.Line1:doubledigestionproductofNCX1.1byBamHⅠandHindⅢ;Line2:singledigestionproductofNCX1.1byHindⅢ;Line3:singledigestionproductofNCX1.1byBamHⅠ;Line4:untreatedNCX1.1plasmid;Line5:Marker.图3.应用BamHⅠ和HindⅢ双酶切法对大鼠NCX1.1质粒进行分析鉴定。条带1：BamHⅠ和HindⅢ双酶切；条带2：HindⅢ单酶切；条带3：BamHⅠ单酶切；条带4：未处理的NCX1.1质粒；条带5：分子量Marker。如图所示，NCX1.1质粒（8420bp）中分别包含一个限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点，单酶切后生成约8.4kb的单链，符合理论值。条带2为HindⅢ的酶切结果，由于酶的星号活性生成一条杂带。NCX目的基因位于BamHⅠ和HindⅢ酶切位点之间，双酶切生成约5.4kb和3.0kb两条条带。完整的NCX1.1质粒包含多种构像，从而出现多条条带。23451215000bp210000bp27500bp25000bp22500bp21000bp2250bp27500bp12345215000bp210000bp25000bp22500bp21000bpFig4.AnalysisofBamHⅠandHindⅢtreatedratNCX1.4plasmidon1%ethidiumbromide-stainedagarosegel.Line1:Marker;Line2:singledigestionproductofNCX1.4plasmidbyHindⅢ;Line3:singledigestionproductofNCX1.4plasmidbyBamHⅠ;Line4:doubledigestionproductofNCX1.4plasmidbyBamHⅠandHindⅢ;Line5:untreatedNCX1.4plasmid.图4.应用BamHⅠ和HindⅢ双酶切法对大鼠NCX1.4质粒进行分析鉴定。条带1：分子量Marker；条带2：HindⅢ单酶切；条带3：BamHⅠ单酶切；条带4：BamHⅠ和HindⅢ双酶切；条带5：未处理的NCX1.4质粒。如图所示，NC