病毒制造

病毒制造VIRUSMANUFACTURING从负到正的大变革HUGETRANSFORMATIONFROMNEGATIVETOPOSITIVE主讲：张婷思考：•什么是病毒（生物学概念）？•病毒为何会得到化学化工专家的重视？•M13噬菌体病毒的结构是如何的？•要获得所需的噬菌体，需要经过哪些步骤进行改造？•M13噬菌体病毒有何应用？1.病毒制造——从大千世界说起•大千世界——“活”的世界：动物、植物、微生物。1.病毒制造——从大千世界说起•什么是病毒？（生物学概念）•病毒（Virus）由一种核酸分子（DNA或RNA）与蛋白质（Protein）构成或仅由蛋白质构成。病毒个体微小，结构简单；没有细胞结构，没有实现新陈代谢所必需的基本系统，病毒自身不能复制。但是当它接触到宿主细胞时，便脱去蛋白质外套，它的核酸（基因）侵入宿主细胞内，借助后者的复制系统，按照病毒基因的指令复制新的病毒。•目前，科学界公认的对病毒的定义是只能在活着的宿主细胞内复制的感染源。①形体极其微小，多数病毒直径在100nm(20~200nm），较大的病毒直径为300－450纳米（nm），较小的病毒直径仅为18-22纳米。②没有细胞构造，其主要成分仅为核酸和蛋白质两种，故又称“分子生物”；③每一种病毒只含一种核酸，不是DNA就是RNA。④既无产能酶系，也无蛋白质和核酸合成酶系，只能利用宿主活细胞内现成代谢系统合成自身的核酸和蛋白质成分。⑤以核酸和蛋白质等“元件”的装配实现其大量繁殖。⑥在离体条件下，能以无生命的生物大分子状态存在，并长期保持其侵染活力。⑦对一般抗生素不敏感，但对干扰素敏感。⑧有些病毒的核酸还能整合到宿主的基因组中，并诱发潜伏性感染。⑨还有些病毒是没有DNA或RNA的，例如朊病毒，它是亚病毒（类似于病毒），只有蛋白质的那一类，它以病毒为寄主。病毒能增殖、遗传和演化，因而具有生命最基本的特征。其主要特点：•病毒几乎能感染所有的细胞生物并对其产生病害，如感冒、禽流感、非典型肺炎、肝炎、流行性出血热、艾滋病……1.病毒制造——从大千世界说起埃博拉病毒•“埃博拉”病毒是人类迄今为止所发现的死亡率最高的一种病毒，死亡率在50％至90％之间。世界卫生组织公布的最新数字说，自1976年发现这一病毒以来，全世界的感染者已达1500多例，其中已有1000多人死亡。•“埃博拉”病毒的形状宛如“如意”，极活跃，病毒主要通过体液，如汗液、唾液或血液传染，甚至握一握手就会传染。潜伏期为2周左右。感染者均是突然出现高烧、头痛、咽喉疼、虚弱和肌肉疼痛。然后是呕吐、腹痛、腹泻。发病后的两星期内，病毒外溢，导致人体内外出血、血液凝固、坏死的血液很快传及全身的各个器官，病人最终出现口腔、鼻腔和肛门出血等症状，患者可在24小时内死亡。SARS病毒•SARS病毒是冠状病毒的一个变种，是引起非典型肺炎的病原体。变种冠状病毒与流感病毒具有亲缘关系，但它是非常独特的一种冠状病毒，在2002年冬到2003年春肆虐全球的严重急性呼吸综合征（SARS、传染性非典型肺炎）的元凶就是这种冠状病毒。•2013年，中国科学院武汉病毒研究所研究员石正丽带领的国际研究团队分离到一株与SARS病毒高度同源的SARS样冠状病毒，进一步证实中华菊头蝠是SARS病毒的源头。人类免疫缺陷病毒•人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus;abbr:HIV），即艾滋病（AIDS，获得性免疫缺陷综合征）病毒，是造成人类免疫系统缺陷的一种病毒。1981年，人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒（Lentivirus），属逆转录病毒的一种。•HIV通过破坏人体的T淋巴细胞，进而阻断细胞免疫和体液免疫过程，导致免疫系统瘫痪，从而致使各种疾病在人体内蔓延，最终导致艾滋病。由于HIV的变异极其迅速，难以生产特异性疫苗，至今无有效治疗方法，对人类健康造成极大威胁。•2015年3月4日，多国科学家研究发现，艾滋病毒已知的4种病株，均来自喀麦隆的黑猩猩及大猩猩，是人类首次完全确定艾滋病毒毒株的所有源头。病毒的结构2.病毒的辅助结构有些病毒核衣壳外还有一层脂蛋白双层膜状结构，是病毒以出芽方式释放，穿过宿主细胞膜或核膜时获得的，称之为包膜。在包膜表面有病毒编码的糖蛋白，镶嵌成钉状突起，称为刺突。有包膜病毒对有机溶剂敏感。包膜功能：①保护核衣壳；②促进病毒与宿主细胞的吸附；③具有抗原性。1.病毒的基本结构有核心和衣壳，二者形成核衣壳。核心位于病毒体的中心，为核酸，为病毒的复制、遗传和变异提供遗传信息；衣壳是包围在核酸外面的蛋白质外壳。衣壳的功能：①具有抗原性；②保护核酸；③介导病毒与宿主细胞结合。病毒出现假说：1．蛋白质、核酸遗失说：•大生物（此处大生物意思是具有细胞结构的生物，区别于病毒的非细胞结构生物）由于细胞脱落和破裂，导致游离的蛋白质和DNA、RNA的出现，在某种情况下，这些蛋白质由于化学作用形成了一个内部可容纳小分子的结构，里面裹着DNA或者RNA，甚至单独的蛋白质和单独的DNA、RNA游离。2．生命起源说：•病毒是最原始的生命体，早在没有细胞之前就有病毒存在，那时的病毒还只限于蛋白质和核酸，没有表现出病毒的寄生特征，当细胞体生物出现之后，个别这种蛋白质和核酸或他们的复合体表现出寄生性。病毒在化学化工中的“魅力”•化学化工专家利用病毒的超微结构和非凡的自我复制能力，制造和组装了使人类从中受益的各种功能结构。•利用生物体系实现化工产品生产的生物化工技术，是化学化工的一个重要方向。“活”的生物体，拥有最神奇的化学分子合成、新物质创造的能力。•病毒通常为纳米级别，病毒的衣壳蛋白、内表面和中间界面都可以进行基因工程改造或者化学修饰。•作为纳米级的生物模板，病毒在新型电子材料和电池开发、化学工业催化剂制备、生物传感器开发和痕量化学品检测、重大疾病治疗等领域将发挥巨大作用。2.病毒制造的科学基础•病毒是目前已知的结构最简单、“活”的生命单位。有些病毒侵染的对象是特定的微生物和植物，对人类安全无害，如丝状的M13噬菌体、球状的MS2和T7噬菌体、长杆状的烟草花叶病毒、多面体形状的豇豆花叶病毒等。为什么要采用纳米级别的“病毒”颗粒作为模板，制造所需的分子机器或材料以实现所期望的功能呢？•纳米尺度时，材料的表面结构和电子性质会发生显著改变，产生表面效应、量子尺寸效应、量子隧道效应及库伦阻塞效应等新性质，从而赋予其不同的特性和功能。如：晶粒尺寸在纳米量级的金属催化剂有更高的催化活性、选择性和稳定性。•生物拥有最神奇的靶标定位和检测、材料合成、加工和功能实现的能力。如：抗体蛋白能在成千上万个配体分子中寻找到自己特异性识别的抗原并与之结合；DNA分子依靠碱基之间特定的互补配对规则精确自组装形成双螺旋结构；酶分子可以特异并专一性的与特定的底物结合进行高效催化。抗体-抗原特异性分子识别DNA自我复制时的碱基结合DNA分子精确自组装2.病毒制造的科学基础•病毒制造的实质，就是一种多学科交叉的生物纳米前沿技术。•生物纳米技术的主要研究内容：将纳米技术和生物体系的独特优势相结合，借助迅速兴起的生物纳米技术，模仿生物系统的能力来转化和传输能量、创造生物质、合成专用有机化学品、实现特异性识别和检测、发送和传导信息、储存信息、进行有序和可控运动、自组装和复制等。•简单地说，只要改造病毒的基因，就能得到需要的特殊病毒结构，从而具有精心设计的新功能。2.病毒制造的科学基础M13噬菌体病毒•野生型M13噬菌体长800~900nm，直径6~10nm。它的单链环状DNA分子有6407个碱基，编码噬菌体的11种蛋白，其中，最终成熟的噬菌体颗粒由5种衣壳蛋白（结构蛋白）组成，包括周身包覆的p8衣壳蛋白（pVIII蛋白或g8p）、一个末端的p3衣壳蛋白（pIII蛋白或g3p）和p6（pVI或g6p）以及另一个末端的p7（pVII）和p9（pIX）衣壳蛋白。其他6种由其DNA编码的蛋白仅出现在DNA复制和噬菌体装配的过程中。•在M13噬菌体的5种衣壳蛋白中，末端p3蛋白和周身p8蛋白最早、最广泛地被用于基因改造和各种新功能的实现。•成熟的p8蛋白是含有50个氨基酸残基的螺旋蛋白，大约有2700个拷贝，呈五倍螺旋对称重复排列，形成噬菌体的柔性圆柱体衣壳的主要部分，将单链环状的基因组DNA包裹于其内部。•P3蛋白是5个拷贝的次要衣壳蛋白，它通过p6蛋白附着在噬菌体颗粒上，是噬菌体吸附宿主细胞所必需的。•蛋白的结构由它的单链DNA基因决定。通过剪切、插入和连接新设计的基因序列到p3或p8等基因的上游，扩增后的新M13噬菌体就可以在相应衣壳蛋白的末端展示出新的精细结构，并具有相应的新功能，如特异性地吸附不同的金属离子。M13噬菌体病毒M13噬菌体病毒•M13噬菌体是一个雄性特异性大肠杆菌噬菌体，当基因改造后的M13噬菌体病毒侵染了大肠杆菌细胞，就会通过细菌的性菌毛与噬菌体的次要衣壳蛋白p3相互作用，去除主要衣壳蛋白p8，使噬菌体DNA能侵入细菌细胞内。被M13感染的细胞并不裂解而是继续生长，但生长速率仅有正常的1/2至1/3。•每个宿主细菌细胞每代可产生几百个病毒颗粒，从细胞内释放后就可以在培养液中大量积累，产生不计其数的具有新外壳结构的M13病毒颗粒。•通过基因改造、侵染细胞、复制、组装、释放和扩增等一步步生物过程，可获得大量的、具有基因改造后的新衣壳蛋白结构的噬菌体并得以应用。3.病毒制造的大事业•制造病毒电池锂离子电池的工作原理•锂离子电池由正极、负极和电解液组成。正极材料通常采用磷酸铁锂；负极采用石墨；电解液采用锂盐的有机溶剂溶液，以提供锂离子。正极材料的锂离子嵌入位点越多，电池电量越大。当常规的磷酸铁锂作为正极时，提供的锂离子嵌入位点数量还不够多，因此不能满足手机电池长时间待机的需求。M13噬菌体作为生物模板来制备病毒电池•美国麻省理工学院的Belcher教授研究组提出！(a)M13噬菌体分子(b)周身p8衣壳蛋白吸附磷酸铁噬菌体分子进行自组装，装配呈病毒电池的正极和负极石墨，之后，它们与锂盐电解液搭建成高效的病毒电池。(c)末端p3蛋白识别并“抓住”碳纳米管病毒电池•这种奇妙的病毒电池，具有储能高、体积小、环境友好、常温自组装等优点，功率比锂电池提升10倍，手机的待机时间有望保持数周甚至数月。清除重金属和化学品污染•六价铀：具有致命威胁的核污染，能溶解在地下水中，随地下水到处扩散。•治理核污染的重要手段：将可溶于水的六价铀还原成不溶于水的四价铀。清华大学的研究人员首先在温和条件下快速合成了分散性很好的直径约为10nm的球型单晶面心立方FCC-Fe纳米颗粒，再进一步利用M13噬菌体和FCC-Fe形成耦合体系，把携带着纳米铁颗粒的M13噬菌体病毒加入到含有六价铀的污水中，纳米铁快速将六价铀还原成不溶于水的、2~5nm的UO2纳米晶，沉积在M13噬菌体病毒的表面，并可以和病毒颗粒一起，方便回收。M13噬菌体上的Fe纳米颗粒1个FCC-Fe纳米颗粒采用噬菌体介导的铁纳米颗粒高效还原六价铀处理镉离子•镉（Cd）离子：镉可通过食物链于生物体内富集，从而引起人体的慢性中毒，对肾、脾、胰等内脏器官和毛发、骨骼都能产生不同程度的损害，镉离子能溶解在水中，随水到处流动，污染扩散。•镉的治理：利用单质铁还原镉离子生成不溶于水的物质。•可利用携带纳米铁颗粒的M13噬菌体病毒加入到含镉废水中发生氧化还原反应，并使不溶于水的镉沉积在病毒表面而回收处理。•由于还原生成的镉颗粒易于覆盖在零价铁颗粒的表面而导致氧化还原反应效率显著降低。改进方法二价镉离子介导靶向给药、医学诊断或检测噬菌体展示技术是一种大规模生物筛选技术，通过将不同的外源多肽或蛋白与M13噬菌体病毒的p3蛋白末端相融合，可以构建得到含有大量待筛选多肽或蛋白分子的M13病毒库，其数量在109~1011。以某个靶标蛋白或重要物质为目标进行生物筛选，就可以快速获得能和靶向目的物质特异结合的多肽或蛋白分子。这些筛选得到的分子既可以作为一种检测靶标物质的试剂，也可以作为“跟踪导弹”，在生物体内定向跑到靶