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实时荧光定量PCR（fluorescentquantitativePCR，FQ-PCR）分子生物学实验技术聚合酶链式反应(PCR)可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。实时定量PCR技术(fluorescentquantitativePCR，FQ-PCR)，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。实时荧光定量PCR是一种新型诊断工具，具有敏感、难、快速、准确的特点，是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法，并且在核酸快速扩增的同时实现模板的定量测定。常规PCR方法的局限性分析：无法对起始模板准确定量,只能对终产物进行分析必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而且EB有毒无法对扩增反应实时检测定量的最佳时期Quantitativeinformationcomesfrommonitoringtheearlystagesofamplification.荧光定量PCR和常规PCR技术的区别常规PCR是通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析（定量不准确）；荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法（准确定量）。荧光定量PCR的原理荧光定量PCR检测时,在普通PCR的基础上加入的荧光化合物可分为非特异性的嵌入荧光染料及特异性荧光(引物)探针两大类型。前者是利用嵌入荧光染料检测,只是简单地反映PCR反应体系中总的核酸量,是一种非特异性的检测方法。后者由于增加了探针的识别步骤,特异性、专一性更高。二者各有优缺点,在不同的研究目的中被应用。它们的基本原理是:扩增呈指数增长,在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物(荧光探针)与扩增产物结合发光,其荧光量与扩增产物量成正比,因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。非特异性的嵌入荧光染料SYBRGreenI核酸染料SYBRGreenI是高灵敏的DNA荧光染料，适用于各种电泳分析，操作简单，无须脱色或冲洗。至少可检出20pgDNA，高于EB染色法25-100倍。SYBRGreenI与dsDNA结合荧光信号会增强800-1000倍，用SYBRGreenI染色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低。可适用于多种电泳分析：琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶电泳，脉冲电场凝胶电泳和毛细管电泳等。非特异性的嵌入荧光染料评价优点：与特异性的荧光探针相比价格便宜只需要设计PCR引物•缺点：由于它和模板的结合是非特异性的，它可以和所有的双链DNA包括引物和非特异性扩增产物结合，不能真实反映目的基因的扩增情况。特异性的荧光探针特异性的荧光探针是把荧光化合物标记到特异性的寡核苷酸上形成荧光标记的DNA探针。通过探针与PCR产物特异性的结合,在PCR过程中可对产物实现均相、实时、定量检测,也适用于多通道检测。TaqMan探针TaqMan探针是一段5’端标记报告荧光基团(R),3’端标记淬灭荧光基团(Q)的寡核苷酸,其序列与模板DNA中的一段完全互补。当探针单独存在时,由于荧光共振能量转移的发生,R的荧光受到Q的猝灭。在PCR过程中,由于TaqDNA酶的5’-3’外切酶活性的作用,使探针的5’端的R被切断,加大了与Q的距离而使荧光恢复。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加,释放出来的荧光基团不断积累。因此,Taqman探针检测的是积累荧光。TaqMan探针评价优点：荧光信号强与其它探针相比设计简单可用于多通道检测可用于SNP的检测缺点：比DNA结合染料价格高CtvalueandReal-TimeQuantitativePCRTheoryCt值（ThresholdCycle）：PCR扩增过程中，扩增产物荧光信号超过基线值（进入指数增长期）时的循环数。一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值。ThresholdCycle,CTCorrelatesstronglywiththestartingcopynumberIslinearwiththelogofstartingcopynumberCt值与模板起始浓度的关系模板起始浓度越高，Ct值越小Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达MathematicImplicationsIdealPCR1CTDifference=2folddifferenceinstartingtemplateamount3.3CTDifference=10folddifferenceinstartingtemplateamount绝对定量可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。相对定量（两个样本中的基因表达水平进行比较）DetermineschangesinsteadystatetranscriptionofageneorgenesExpressionofthegene/sofinterestisnormalizedagainstareferencegene/s(housekeepinggene/s)withnoorinsignificantexpressionvariationExamplesofsomereferencegenes/housekeepinggenesused:b-Actin,GAPDH,18srRNA,b-2Microglobulin,Cyclophilins溶解曲线（MeltCurve）OnlypossiblewithDNABindingdyes(SYBRGreenI)andaftercompletedrealtimePCRDeterminesthetemperatureatwhich50%oftheDNAmoleculesseparateintotwostrands-or“melts”apartDiscriminatesbyMeltingTemperature(Tm),Tmisdependenton:-sequence(G/Ccontent)-lengthMeltcurveshowingtwoamplifiedproductsCollectingat82ºCwouldrecordspecificproductonly实时荧光定量PCR技术的应用目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面：1.DNA或RNA的绝对定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。2.基因表达差异分析。例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证3.基因分型。例如SNP检测，甲基化检测等。随着实时荧光定量PCR技术的推广和普及，该技术必然会得到更广泛的应用。谢谢大家！