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第二章DNA重组克隆的单元操作赵晓梅切接转检增完整的基因克隆过程基因工程的基本条件C用于基因转移的受体菌或细胞A用于基因克隆的载体B用于核酸操作的工具酶Vector：是携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA,它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。第一节载体（Vectors）克隆载体:克隆基因表达载体:表达基因整合载体:通过载体把基因整合到基因组上载体的功能及特征载体的功能为外源基因提供进入受体细胞的转移能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供在受体细胞中的扩增或表达能力载体的功能及特征载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有合适的筛选标记具有较高的外源DNA的载装能力具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点基因工程对宿主细胞的要求宿主细胞是基因克隆中重组DNA分子的繁殖场所，适当的宿主细胞，必须符以下条件：载体的复制和扩增没有严格的限制；不存在特异的内切酶体系降解外源DNA；在重组DNA增殖过程中，不会对它进行修饰；重组缺陷型，不会产生体内重组；容易导入重组DNA分子；符合重组DNA操作的安全标准。基因工程中常用的载体有5类：克隆载体的种类1)质粒（plasmid）2)单链DNA噬菌体M133)噬菌体的衍生物4)柯斯质粒（cosmid）5)动物病毒（virus）一、质粒（plasmid）Plasmid：是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子即cccDNA，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。质粒DNA的分子量范围：1-100kb质粒的生物学特性1、质粒DNA的构型：SC型共价闭合环形DNA（cccDNA）OC型开环DNA（ocDNA）L型线性DNA（cDNA）2、不同质粒的分子量大小差异相当显著：106~108D3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分：复制基因（replicator）、选择性记号、克隆位点LOCSC多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker克隆载体多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker克隆载体（一）质粒的基本特征1、质粒的自主复制性（一）质粒的基本特征2、可扩增性质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系，根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制1-3拷贝stringentplasmid松弛型复制30-50拷贝relaxedplasmid（一）质粒的基本特征3、可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等。非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员。值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程依赖于mob基因产物与其他蛋白因子的相互作用。（一）质粒的基本特征4、质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容质粒的不相容性：分子机制•两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。•两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。（一）质粒的基本特征5、携带特殊的遗传标记•野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：•物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物•物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义（二）质粒的改造与构建天然存在的野生型质粒的局限性：•分子量大、拷贝数低•单一酶切位点少•遗传标记不理想等缺陷不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。质粒的改造与构建的指导思想：1.尽量缩小相对分子质量（３∽１０kb）；2.灭活某些质粒的编码基因，如mob基因；3.具有适当的多克隆位点以便外源DNA插入；4.具有插入失活筛选标志，便于从平板上直接筛选阳性重组子；5.根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件或用于表达产物亲和层析分离的标签编码序列。作为载体的质粒一般具有以下特点：分子相对较小（３∽１０kb）；具有适当的多克隆位点以便外源DNA插入；具有插入失活筛选标志，便于从平板上直接筛选阳性重组子；质粒能携带的外源DNA片段一般较小（15kb）pBR322p：代表质粒BR：代表研究质粒的研究者(Bolivar&Rogigerus)322：与科学家有关的数字含有两个抗生素抗性基因AmpR、TetR单一的BamHI、SalI的识别点都在TetR基因内,单一的PstI识别位点在Amp抗性基因内pBR322带有一个复制起始位点,保证质粒只在大肠杆菌进行复制。（1）元件来源pSF2124质粒的AmpR基因（1）元件来源①复制起点oripMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点②AmpR基因③TetR基因pSC101的TetR基因。（2）长度4363bp（3）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。（4）克隆位点其中9个会导致TetR基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3个会导致AmpR基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24个克隆位点。（5）pBR322的优点①双抗菌素抗性选择标记插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞在Amp或Tet中都死亡。获得携带外源基因载体的寄主细胞在Amp或Tet其中之一中死亡。获得未携带外源基因载体的寄主细胞在Amp或Tet中都生存。AnnealingofComplementary“Sticky”EndsAmpRtetRAmpRtetS插入DNA片段DNAligasepBR322重组体选择方法插入DNA片段外源基因BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因PstITet中存活但在Amp中死亡外源基因抗Amp抗Tet抗Amp抗Amp抗Tet抗Tet重组DNA空载体不含有载体或重组DNA氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy④安全失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。③高拷贝数②分子小，克隆能力大载体越小越好。10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。AnnealingofComplementary“Sticky”Ends质粒载体pUC19pUC系列UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19pUC18/19pUC质粒系列pUC质粒系列也是在pBR322基础上改建成的。它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和复制起始点。去除了pBR322的tetr区段，含LacZ基因的启动子及编码α-肽链的DNA序列（lacZ’），位于lacZ’基因中的靠近5’端的MCS，但不破坏该基因的功能。①复制起点:pBR322的ori但其上失去了克隆位点。②Ampr基因:（1）元件来源③lacZ的启动子:大肠杆菌④lacZ’基因大肠杆菌lacZ的-肽链序列，是LacZ的氨基端片断。pBR322的Ampr基因（2）长度约2.7kb（3）克隆位点10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的5’端。pUC18/19Ampicillin抗性和lacZ的肽互补(蓝白斑）相结合。（4）选择标记蓝白斑选择原理：①Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside即5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷）-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝-半乳糖苷酶②-半乳糖苷酶Xgal显色反应：③IPTG的诱导作用IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ的C端部分和载体的lacZ’肽都表达。从而互补。但载体MCS上插入外源DNA后，不能产生肽！IPTGX-gal5-bromo-4-chloro-3-indolylβ－D-galactopyranosideGalactosebluedyeβ-galactosidase筛选方法:蓝-白筛选通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。MCS无插入时，互补，蓝菌斑。MCS有插入时，不互补，白菌斑。IPTG诱导的结果：AnnealingofComplementary“Sticky”EndsCutvectorandforeignDNATransformationPlateonampicillin,x-galandIPTGmediumBlueWhitepUC19VectorLacpromoterInsertpUC19重组体选择方法诱导物ZYXPOZYXPO乳糖标志补救（ß-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段lacZX-galLacZ蓝色化合物X-gal（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶（5）pUC系列载体的优点①更小的分子量：如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp。②选择方便Xgal显色、抗菌素双重直接选择。③克隆便利具有多克隆位点（MCS），使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入。④测序方便•其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。穿梭质粒载体（1）穿梭质粒载体的结构人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。（shuttleplasmidvectors）MCS大肠杆菌枯草杆菌穿梭载体大肠杆菌酿酒酵母穿梭载体大肠杆菌动物细胞穿梭载体（2）常用的穿梭质粒载体E.coli复制起点Yeast复制起点Yeast选择标记E.coli选择标记（3）穿梭载体的优点②也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。③可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。克隆、构建表达E.coliAnimalcell①利用大肠杆菌进行基因克隆、表达T载体MCSTvector的克隆过程——简便！TvectorPCRproductT4DNAligaseT-vector两条链的3’端含有一个游离的TPCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个A人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：•克隆质粒常用于克隆和扩增外源基因•测序质粒含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker•整合质粒装有整合酶编码基因及整合特异性的位点序列便于外源基因的整合•穿梭质粒装有针对两种不同受体的复制子便于基因克隆•探针质粒装有报告基因便于启动子等元件的克隆筛选•表达质粒装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件（三）质粒的分类（四）质粒DNA的分离纯化•氯化铯密度梯度离心法质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染•沸水浴法质粒DNA纯度底、快速、操作简便•碱溶法质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间实验原理在pH12-12.5时，线性DNA被彻底变性，但共价闭环质粒DNA虽然H键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。当在溶液体系中加入pH4.8的KAC时，溶液恢复中性，质