金黄色葡萄球菌耐药性研究进展安徽省立医院马筱玲

葡萄球菌耐药性研究进展及药敏试验的临床应用安徽省立医院检验科马筱玲概述金黄色葡萄球菌在自然界广泛分布金黄色葡萄球菌是医院感染重要的致病菌对环境抵抗力强，容易产生耐药性金葡菌主要耐药类型和耐药机制耐青霉素金黄色葡萄球菌：产生β－内酰胺酶，水解青霉素中有效基团。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：获得Mec基因，编码产生PBP2a，亲和力降低耐万古霉素金黄色葡萄球菌：获得耐药基因，细胞壁增厚对大环内酯类抗生素耐药：泵出机制，靶位改变MRSA主要研究进展MRSA临床实验室检测方法SCCmec基因盒研究社区获得性MRSAMRSA的耐药机制在甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA）中含有5种与β－内酰胺类抗生素亲和力高的青霉素结合蛋白(PBP)，总称为PBPs，具有羧肽酶或转肽酶作用，主要参与细胞壁粘肽层的合成。使用β－内酰胺类抗生素时，药物可与PBPs结合，使其功能被抑制，使细胞壁合成受阻，导致细菌因不能抵抗外界的渗透压力而死亡。MRSA的耐药机制MSSA→mecA基因→MRSAmecA能编码合成一种新的青霉素结合蛋白2ａ(PBP2ａ)PBP2ａ能执行PBPs的生理功能，但与β－内酰胺类抗生素的亲和力低，当有β－内酰胺类抗生素存在时，正常的PBPs与之结合，功能被抑制，而PBP2ａ不与其结合，则可替代PBPs发挥作用，使细菌能够正常生长，产生耐药性。mecA或PBP2a阴性的甲氧西林/苯唑西林耐药葡萄球菌是罕见的MRSA检测方法基因水平：mecA基因——PCR扩增法蛋白水平：PBP2a蛋白——胶乳凝聚法表型水平：–琼脂筛选法–苯唑西林纸片扩散法–头孢西丁纸片扩散法–稀释法耐甲氧西林葡萄球菌的检测4%NaCl-6ug/ml苯唑西林盐平板筛选法–培养条件：35℃，24-48小时–结果：＞1个菌落生长，判定为甲氧西林耐药（MR）菌株苯唑西林纸片法：1ug/片–金葡菌11-12mm–凝固酶阴性葡萄球菌≤17mm头孢西丁纸片：30ug/片–金葡菌、路邓≤21mm（2007CLSI)–凝固酶阴性葡萄球菌≤24mm葡萄球菌属-2007头孢西丁纸片扩散法：–修改了对金葡菌和路登葡萄球菌的“S”折点–缩短金葡菌的孵育时间到18小时–增加注释某些菌株可能甲氧西林耐药而头孢西丁敏感56检测葡萄球菌中mecA介导的耐药头孢西丁纸片法折点细菌M100-S16新M100-S17RSRS金葡菌路登葡萄球菌192021*22**凝固酶阴性葡萄球菌24252425*报告甲氧西林耐药**报告甲氧西林敏感57头孢西丁纸片检测葡萄球菌中mecA介导的耐药的孵育**33-35C反射光读结果细菌读取头孢西丁纸片扩散法最终结果在金葡菌路登葡萄球菌18小时(新!)凝固酶阴性葡萄球菌24小时（如耐药，结果可在18小时后报告）58某些菌株的检测可能甲氧西林耐药和头孢西丁敏感…mecA或PBP2a甲氧西林MIC(µg/ml)报告甲氧西林阳性所有R阴性2S阴性4Raa甲氧西林耐药机制除了mecA介导的耐药外，其他罕见…M100-S17中新的陈述-“这些分离菌头孢西丁纸片扩散法检测可能敏感”。CLSIM100-S17Table2C(M2-DD,M7-MIC)葡萄球菌属中甲氧西林耐药的检测59为什么头孢西丁优于苯唑西林?头孢西丁存在时mecA基因以更高水平表达45敏感性/特异性TestsformecA-mediatedResistantS.aureusSensitivity:OXMIC=OXDD=CXDD=PBP2a=mecA*99%98%98%100%Specificity:OXMIC=OXDD=CXDD=PBP2a=mecA100%99%100%100%courtesyofSwensonandTenover*mecA=goldstandard47Sensitivity/SpecificityTestsformecA-mediatedResistantCoNSSensitivity:OXMIC=OXDD=CXDD=PBP2a=mecA*99%99%98%100%Specificity:OXMIC=OXDDCXDD=PBP2amecA*61%67%96%94%***mecA=goldstandard**allerrorsS.warnericourtesyofSwensonandTenover48头孢西丁检测MRS头孢西丁纸片法是..首选用于检测mecA介导的耐药作为苯唑西林的“替代物”(reportoxacillinNOTcefoxitin)对S.lugdunensis只用头孢西丁(不用oxacillindisk)金葡菌：与苯唑西林纸片扩散法相当凝固酶阴性葡萄球菌：较苯唑西林纸片扩散法好MRSASCCmec基因盒研究抗菌药物MSSAMRSA耐药率（%）耐药率（%）氨苄西林68.1*97.7*头孢唑啉4.2*95.3*环丙沙星0.0*73.1*氯霉素9.8*40.0*红霉素62.2*94.2*克林霉素24.4*82.6*苯唑西林0.0*100*呋喃妥因2.23.4青霉素G93.398.8利福平0.0*13.6*四环素26.9*62.8*甲氧苄啶/磺胺甲噁唑15.1*40.7*万古霉素0.00.0庆大霉素14.3*85.0*左氧氟沙星8.9*79.9*MRSA呈多重耐药耐药模式MSSAMRSAP值株数百分率株数百分率对非-内酰胺类抗生素敏感2521.044.7﹤0.05对1～2类抗生素耐药6958.011.2﹤0.05对3类以上抗生素耐药2521.08194.1﹤0.05总计11910086100——MRSA耐药特征及机制PBP2a仅与β－内酰胺类抗生素亲和力降低，为何对其他非β－内酰胺类抗生素呈交叉耐药？mecＡ基因的结构mecＡ基因盒的J区有吸引和整合外来基因的功能，mecＡ基因与其整合的基因以基因复合体的形式存在，这个基因复合体叫做“葡萄球菌染色体mec基因盒”（staphylocossalcassettechromosomemec,SCCmec）SCCmec不是MRSA菌株所固有的，而是一个外来的可移动的插入片段。mecＡ基因的结构SCCmec基因盒包括两种基因复合体–ｍｅｃ基因复合体–染色体盒重组基因复合体(ccr)MRSA基因分型及其意义mec复合体组成：mecA、调节基因（mecＲ1）和抑制基因(mecＩ)–mecA是耐药性表达的结构基础–mecI编码的抑制因子(mecI蛋白)–mecR1基因在诱导剂(如β－内酰胺类抗生素)的作用下编码产生诱导因子(mecR1蛋白)，能够去除mecI蛋白对mecA的阻遏作用，使mecA转录产生PBP2ａMRSA基因分型及其意义在MRSA的mec基因复合体中mecR1和mecI可同时存在，也可仅有mecR1存在，而mecI缺失。根据mec基因复合体结构，可分为A和B型–A型：IS431–mecA–mecR1–mecI–B型：IS431–mecA–mecR1–IS1272A型及B型mec基因复合体mecAmecR1mecIIS431mecAmecR1IS1272IS431MRSA基因分型及其意义在mec基因复合体中，IS431的存在有吸引其他耐药基因的功能,使之整合到SCCmec中，因此MRSA不但对β—内酰胺类抗生素耐药，对其他抗生素也存在抗药性,IＳ431插入子是染色体内多重耐药基因存放的位点。MRSA基因分型及其意义染色体盒重组基因复合体(ccr)，有两种点特异性重组基因组成，ccrA和ccrB，负责SCCmec基因盒的移动，ccrA和ccrB可分为1、2、3型。ccrA1ccrB1ccr1型ccr2型ccrA2ccrB2ccr3型ccrA3ccrB3MRSA基因分型及其意义根据mec和ccr基因复合体结构，可将SCCmec基因盒分为四型（见图）。Ⅰ型SCCmec复合体Ⅰ型：由B型mec基因复合体和ccr1型基因复合体组成。多见于早期分离的MRSA菌株，代表株为NCTC10442，是1961年首次从英国分离出的MRSA菌株。在Ⅰ型中除mecＡ基因外没有其他耐药基因。Ⅰ型SCCmec复合体mecAmecR1IS1272IS431ccrA1ccrB1B型mec基因复合体ccr1型Ⅱ型：由A型mec基因复合体和ccr2型基因复合体组成。是目前医院感染MRSA中常见的基因型，代表株为Ｎ315，是1982年从日本分离的MRSA菌株。在Ⅱ型SCCmec中含有完整的pUB110质粒和Tn554转座子，pUB110与细菌对氨基糖苷类抗生素、卡那霉素、妥布霉素耐药有关，Tn554编码红霉素、壮观霉素抗药性。Ⅱ型SCCmec复合体Ⅲ型：由A型mec基因复合体和ccr3型基因复合体组成。也是医院感染MRSA常见的基因型，代表株85/2082，在Ⅲ型SCCmec中除mecA以外，还含有完整的pT181质粒、Tn554转座子和ψTn554。ψTn554是编码抗镉的基因，pT181质粒编码四环素耐药、Tn554编码红霉素、壮观霉素抗药性。Ⅲ型SCCmec复合体Ⅳ型：由B型mec基因复合体和ccr2型基因复合体组成。是新出现的社区感染MRSA常见基因型，MW2和CA05为IVa型代表菌株，8/6-3P为IVb型代表菌株在IVa和IVb型SCCmec中除mecA外，不含有其他耐药基因。Ⅳ型SCCmec复合体抗菌药物耐药株数（耐药率%）Ⅱ型（4株）Ⅲ型（24株）Ⅳ型（2株）合计（30株）氨苄西林4（100）24（100）2（100）30（100）头孢唑啉4（100）24（100）2（100）30（100）氯霉素2（50）14（58.3）0（0）16（53.3）克林霉素4（100）24（100）0（0）28（93.3）红霉素4（100）24（100）0（0）28（93.3）庆大霉素4（100）23（95.9）0（0）27（90.0）呋喃妥因0（0）2（8.3）0（0）2（6.7）苯唑西林4（100）24（100）2(100)30（100）青霉素G4（100）24（100）2(100)30（100）利福平1（25）2（8.3）0（0）3（10）四环素4（100）24（100）0（0）28（93.3）甲氧苄叮/磺胺甲噁唑1（25）5（20.8）0（0）6（20）万古霉素0（0）0（0）0（0）0（0）左氧氟沙星4（100）23（95.9）0（0）27（90.0）基因型别菌株数EryGenLevCliChlTetSxtNitRipⅡ2ＲＲＲＲＲＲＳＳＳⅡ1ＲＲＲＲＳＲＲＳＳⅡ1ＲＲＲＲＳＲＳＳＲⅢ2ＲＲＲＲＲＲＲＲＲⅢ2ＲＲＲＲＲＲＲＳＳⅢ7ＲＲＲＲＲＲＳＳＳⅢ11ＲＲＲＲＳＲＳＳＳⅢ1ＲＲＳＲＲＲＳＳＳⅢ1ＲＳＲＲＲＲＲＳＳⅣ2ＳＳＳＳＳＳＳＳＳ研究结论本地区MRSA流行株以SCCmecⅢ型为主，表现为对抗生素多重耐药。发现2株SCCmecIV型的MRSA，仅对β－内酰胺类抗生素耐药，而对多种非β－内酰胺类抗生素敏感。MRSA的耐药表型与基因型有明显的相关性，但仅使用SCCmec基因分型不能完全解释MRSA的耐药表型。社区获得性MRSA（CO-MRSA)自从CA—MRSA于1982年首先在美国密西西比州被报道以来，CA—MRSA在MRSA感染中所占的比例呈逐年上升的趋势。Fridkin等报道200l～2002年间CA-MRSA已占MRSA感染的8％～2O％CA—MRSA可以通过皮肤直接接触传播，也可通过共同运动器械、餐具等间接传播。CA一MRSA感染不仅发生在社区家庭成员之间，还可发生于学校、幼儿园和监狱等人口集中的社区中。2005年，Kazakova等报道了在职业运动员之间传播的CA—MRSA社区获得性MRSA（CO-MRSA)多为SCCmecIV型与典型的医院感染MRSA（H-MRSA）比较，主要表现为对β－内酰胺类耐药，而对多种非β－内酰胺类抗生素的敏感性可能增加，甚至对头孢类抗生素也表现为敏感毒力更强，可产生杀白细胞毒素。较多的研究认为，CO-MRSA并非其源于H-MRSA，是近年来出现的一种新的耐药模式，在美国、澳大利亚和欧洲引起广泛重视