绒山羊研究进展报告

LOGO高产绒量转基因绒山羊新品种培育任务进展周欢敏内蒙古农业大学2009年12月11日报告内容研究进展•绒山羊绒毛生长相关基因•FGF-5转基因克隆山羊成果总结已获成果后期工作预计开展的工作承担任务转FGF-5基因高产绒量绒山羊品种的培育2高产绒量转基因绒山羊新品种培育内蒙古农业大学承担任务1.与绒山羊产绒量相关的FGF-5基因毛囊特异表达载体的构建以及转基因细胞系的建立。2.生产转FGF-5基因的克隆胚胎100枚。3.培育高产绒量转基因绒山羊5-10只。4.筛选出2-3个未知的与产绒量相关的功能基因。5.转基因载体构建和转基因检测研究进展一、绒山羊绒毛生长相关基因的获得与筛选（一）利用抑制消减杂交法(SSH)构建绒山羊次级毛囊生长期（正）与休止期（反）的两向消减文库（二）应用cDNA芯片与SSH结合筛选绒山羊绒毛生长相关的差异表达基因（三）绒山羊出生2周羊羔皮肤和70天胎儿皮肤差异表达基因的筛选（一）利用抑制消减杂交法(SSH)构建绒山羊次级毛囊生长期（正）与休止期（反）的两向消减文库1.SSH消减杂交兴盛期毛囊和休止期毛囊cDNA片段互为Tester和Driver，两轮消减杂交后，得到差异表达基因片段123456789101112131415161718192021222324255000bp3000bp2000bp1200kb800bp500bp250bp1-12.反库PCR检测结果；13-24.正库PCR检测结果；25.MarkerIII蓝色：约20%克隆质粒中无插入片段随机挑取正反库单克隆各12个，以T7或SP6为引物，经PCR扩增，约80%白色克隆质粒中有插入片段，多数插入片段长度在0.3-1kb，表明文库构建成功2.差异表达基因cDNA片段的T/A克隆及鉴定3.序列测定及结果分析正向消减文库反向消减文库有效序列(条)313355平均长度(bp)693596Contig数73110有效序列信息注：正反向SSH文库各随机挑取750个克隆进行测序视大于100bp的合格高质量序列为有效序列经生物信息学分析，发现与山羊类同源的序列较少，正向SSH消减文库309条序列中，山羊只有57条；反向消减文库344条中，山羊的有35条。因此，所获得的数据，极大丰富了山羊的数据资源。4.＊序列注释结果的功能分类ForwardSSH(224)Reverse-SSH(300)Celldivision1513Cellsignaling/communication4449Cellstructure/motility3052Cell/organismdefense1321Metabolism2446Gene/proteinexpression3337Unclassified6582共向GenBank注册非冗余ESTs126条，序列号为64970025~64970150。＊对已知功能基因的ESTs进行分类，（二）应用cDNA芯片与SSH结合筛选绒山羊绒毛生长相关的差异表达基因在消减文库的基础上，进行了两次荧光交换的cDNA芯片杂交，以筛选差异表达基因，芯片杂交结果见下表生长期休止期差异基因6个10个上调基因3个9个下调基因3个1个注：主要试剂为晶芯系列产品生长期次级毛囊的差异表达基因CloneLength(bp)E-valueESTnameUp-regulatedGenesZ3F114630.00E+00Bostaurussortilin-relatedreceptorcontainingLDLRclassArepeatspreproprotein(SORL1)Z5D6596e-104HomosapiensmRNAforfibroblastgrowthfactorreceptorsubstrate2Z80509未匹配Down-regulatedGenesZ5H12251e-111Bostaurussproutyhomolog2(Drosophila)(SPRY2)Z1C105859.00E-56Pongoabelii,memberRASoncogenefamily(RAB11A)Z42199未匹配发现6个次级毛囊生长期的差异基因：上调基因3个：Sortilin、成纤维细胞生长因子受体底物及未知基因1个；下调基因3个：SPRY2、Ras癌基因家族成员RAB11A及未知基因1个。生长期未匹配2个Z80TGAGAGCTTTAAAATTCCTGCAATGGTGCAAATTTTCTTAATTGAAAAATAATAAAATAAGGAGGAAAAAAAATCTAAATTTAGTCCTGCACTGAAATCCTCACCTTTGAAAAACTCTCAAGATAAAGATTTAGTAGAAACCCCATTCTCCATCATACTCTGGCTGATAAAGAAAACACAGCCACGCAAACAATAATTTAACACGAGCCAAAACAAAAGTGTTTTCAGAAAGAAGCTAGTGTTGGCGATTTAAAGGTTTCCACTATGTCTGAGCATCTCCAATACAAATACCTTATGTATTTAAGGGAAGCTTCACAAGTCAAAAGCAATTTCACATAAATGATTCAATTCTTACCGTAAGCCCGTGACTTAAGCAGGGTAGGGATTATCTGCCTGGATTTGAGACATTACCAACCCAGTAAAAACGGGGATAAAAGACTGGCTATAAAAATGTAGCACTTCGTTTCCAAAAAAAAAAAGTATTCTTACTAAAACAACAAAATGGCCCGZ42CTTGAGTTAGTAGGAGCTTTTACATGTGGTAAAAGGCTATTACTTAAACTCCATGAATTAAGGTAATTCTAACATTCTCCATTTTATGGCTCTAGCACCAAAGACCCAAAGCAGTGATACTGCATTGAACCATCCTTAGATTGCAGGCCCACTCTGGAGGCCAAGGTCCTAGGTGTTTTGTTGAAGGCTGTGTGTAAGT休止期次级毛囊的差异表达基因CloneLength(bp)E-valueESTnameUp-regulatedGenesF6H32756.00E-43BostauruszincfingerCCCH-typecontaining18(ZC3H18)F15850e-139BostauruszincfingerproteinZNF33BF6A6683e-162Bostaurustype2desmocollinF4H12422.00E-95Bostaurusmortalityfactor4like1(MORF4L1)F1B16410.00E+00BostaurusbasicFGF-repressedZicbindingproteinF2E10366e-173Bostaurus,memberRASoncogenefamily(RAB18)F1C12560e-125Bostaurusosteonectin(SPARC)F88494未匹配F59551未匹配Down-regulatedGeneF4H10987e-140BostaurusS100calciumbindingprotein休止期未匹配2个F59TTTTTCTCCCTAAAAAAAAAGAATTTTTTTTTTTGTTTTTTTCTAAAAAATGAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCGCCGGGGGGGGGGGGGAAAACTAAAAATATCGGGGGGGGGGGGACCCAAGGGAAAATAGGGTGGGTGCCAAAACCCACCCCCCCCCGGCACCCGAAAAAACCCAAAAAAAAGACCCCCCCCCCCCCTTCTTATGCCACCACCCCCCCCCCTGAAAAAAACAACCACCCATAAAAAAAAACACAACAAATACTCTCCGCCGGGTTGTTTTCAGGGAGCCGGCAAAAAAAAAAACAACAAAACTGCCCAAAAAATCCCTAACCAAACGACAACCCCCAACAATAAAAAGAAACAACCCCCCCCCCGCAGGCACCGCTCATGAAATAAAGTTCCCCAACACAAAAAAGGGGGGGGGGTTTTCCGCCCCCCCCCCACACCATCAAATATAATTGCCCCCCCCCCCCAGGCGATAAAGGGGGAGAAACCCCCCCCCCCGGCGGGGGGGGACGGTTTTTTTTCTTTTTTTTGGGGGCCCCCCCAF88TACCCGCCCCGTCACAACGCCGAGATCATTATGGAGCTCCCGCGGGTGCTGGCTAACAGTTCCCCAATTCCTCCCTTCATTATCTTTCTTCCTGTTTCTCTTGATATTGAGGTGGTACATGAAAGGGAGGCAAGGGAAGGGAAAGGGATATGTGCATGGGATGGGATAAAGAAATTTTGCCTAGAAGTAACAAACTTTCATCGTTATAAAATTTGGTTCTCCTTGTTGAGTTTAAACAAAATGACTAATTGTTGTATTTTCTATCCAATCTCTAGCTGCACCATTTTAGACTCAATCCAGCCCGCACAACCCCGAGATGTCACTATTTCCGCCTCCTGTAGGACGACGATATGGGAGGGCCCGCCGCTCGTCGTATGAATAGCATGCCCATTCCAGTCTTCCTACCAAACCCTTGCCTTACCATGGAAGCCATCCTTTCCAGAGTTGGTTGTTATCCGCTCACTTTCCGGACTTCTTCCCACCCCCTTTTTGGA发现10个次级毛囊休止期的差异基因：上调基因9个：锌指蛋白ZC3H18及ZNF33B、II型桥粒糖蛋白、MORF4L1、Zic结合蛋白、Ras癌基因家族成员RAB18、SPARC、未知基因2个；下调基因1个：S100钙连接蛋白。（三）绒山羊出生2周羊羔皮肤和70天胎儿皮肤差异表达基因的筛选与70天胎儿皮肤相比，出生2周羊羔皮肤组织中表达上调大于2倍的基因共有1370个；表达下调大于2倍的基因共有1127个。这些差异表达的基因参与细胞内的代谢、转录调控、应激/免疫反应、结构组成等。应用Affmetrix公司牛基因组芯片与SSH结合筛选差异表达基因其中与毛囊发育生长有关的重要基因有:SOX2、SOX9和SOX18BMP-2和BMP-4FK506SOX基因家族编码转录因子，在动物发育过程中发挥重要的作用。SOX家族的3个成员SOX2、SOX9和SOX18出现在差异表达的基因中。在羊羔皮肤中上调的有SOX9，在胎儿中上调的有SOX2、SOX18。SOX18的突变会引起ragged(Ra)缺陷（PennisiDetal,2000；Jamesetal，2003），杂合体几乎完全缺少胡须和被毛，突变小鼠毛被中zigazg毛的比例减少，另外还观察到毛干中的黑色素着色减少。因此SOX18对于次级毛囊大小和比例有重要的作用。是否在绒山羊次级毛囊的密度和大小也有关还有待于进一步研究。BMP-2和BMP-4被Noggin抑制活性的平衡状态将刺激毛囊发育的开始。有意思的是选择性的永久缺失Noggin将影响次级毛囊（代表了90%的小鼠毛囊）的诱导过程，而初级毛囊则出现凋亡（Tatianaetal，2002；Saitohetal，1998）。BMP2和BMP4在出生2周羊羔中表达量上调分别为6倍和2倍。表明这一阶段仍然是毛囊大量发育的阶段，这与绒山羊次级毛囊在出生后仍然继续发育相一致。FK506结合蛋白也出现在小鼠的毛乳头细胞中（Sleemanetal，2000）。FK506结合蛋白家族的成员除了5上调外，其余的7、9、10、11均在在新生羔羊皮肤中下调。说明这个家族的成员7、9、10、11在毛囊发育早期发挥