陈纭老师第九章二氢吡啶类-钙通道阻滞药物的分析

L/O/G/O第九章二氢吡啶类钙通道阻滞药物的分析陈纭QQ：29583133电话[phone]安徽医科大学学习要求：•1.掌握：二氢吡啶类药物的基本结构及主要理化性质；结构、性质与分析方法间的关系；铈量法的原理、方法及注意事项。•2.熟悉：二氢吡啶类药物的化学鉴别反应及有关物质检查的方法；•3.了解：二氢吡啶类药物其他的鉴别试验及含量测定方法、及体内分析中样品的处理方法。二氢吡啶类钙通道阻滞药物也称钙拮抗剂，广泛应用于缺血性心血管疾病，高血压、脑血管疾病等的治疗。第一节结构与性质一、常见药物的结构二氢吡啶类药物的基本骨架：HNCH3R1R2OOCCOOR3R4R5123456为活性必需，变成吡啶环或六氢吡啶环活性消失为活性必需，若为乙酰基或氰基活性降低，若为硝基则激活钙通道邻、间位有吸电子基团活性较佳，对位取代活性下降取代基与活性关系次序：H＜甲基＜环烷基＜苯基或取代苯基影响作用部位，3,5位取代酯基不同，为手性中心。HNCH3CH3CH3OOCCOOCH3NO2硝苯地平HNCH3CH3CH3CH2OOCCOOCH3NO2尼群地平HNCH3CH3(CH3)2CHOOCCOO(CH2)2OCH3NO2尼莫地平HNCH3H2NCH2CH2OCH2CH3CH2OOCCOOCH3ClSO3H苯磺酸氨氯地平HNCH3CH3CH3CH2OOCCOOCH3ClCl非洛地平激活开放钙通道的二氢吡啶类化合物HNNO2OOFFFHNOOOOOFFFHNNO2OONONBayK8644PN202791CGP28392二、主要理化性质1.二氢吡啶环的还原性二氢吡啶环，具有还原性，可用氧化还原反应鉴别和氧化还原滴定法进行含量测定。2.硝基的氧化性苯环上大多有硝基，具有氧化性，可被还原剂还原为芳伯氨基，可用重氮化-偶合反应鉴别。3.二氢吡啶环氨基质子解离性二氢吡啶类药物与碱作用后，1,4-位氢可以发生解离，形成共轭环发生颜色变化，可以进行鉴别。4.稳定性二氢吡啶类药物遇光极不稳定，易发生光化学反应，因此要避光保存此类药物。5.旋光性本类药物的C4位多为手性碳原子，具有旋光性。6.吸收光谱特性本类药物具有芳环，有明显的紫外吸收特征和红外特征。第二节鉴别试验一、化学鉴别法（一）与亚铁盐反应二氢吡啶类药物苯环上硝基具有氧化性，可将氢氧化亚铁氧化为红棕色氢氧化铁沉淀。ChP2010尼莫地平的鉴别：取本品约20mg，加乙醇2ml溶解后，加新制的5%硫酸亚铁铵溶液2ml，1.5mol/L硫酸溶液1滴与0.5mol/L氢氧化钾溶液1ml，强烈振摇，1分钟内沉淀由灰绿色变为红棕色。（二）与氢氧化钠试液反应ChP2010硝苯地平的鉴别：取本品约25mg，加丙酮1ml溶解，加20%氢氧化钠溶液3～5滴，振摇，溶液显橙红色。（三）沉淀反应ChP2010尼莫地平注射液的鉴别：取本品适量（约相当于尼莫地平20mg），置分液漏斗中，加乙醚30ml振摇提取，静置，分取乙醚层，置水浴上蒸干，放冷，残渣加乙醇2ml，搅拌使溶解，移至试管中，加1%氯化汞溶液3ml，即发生白色沉淀。（四）重氮化-偶合反应BP2010硝苯地平的鉴别：取本品25mg，加10ml盐酸-水-乙醇混合溶液（1.5∶3.5∶5），温热，加入锌粒0.5g，放置5分钟，滤过，滤液加亚硝酸钠溶液（10g/L）5ml，放置2分钟，再加入氨基磺酸铵溶液（50g/L）2ml，摇匀，加入盐酸萘乙二胺溶液（5g/L）2ml，即显红色（持续5分钟以上）。二、分光光度法（一）紫外分光光度法ChP2010尼群地平软胶囊的鉴别：避光操作。取本品的内容物约1g，置100ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，取10ml，置100ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，在353nm与303nm的波长处分别测定吸光度，在353nm与303nm的吸光度比值应为2.1～2.3。（二）红外分光光度法ChP2010尼群地平片的鉴别：避光操作。取本品（约相当于尼群地平100mg），研细，加丙酮10ml，振摇使溶解，滤过，滤液暗处挥干，残渣经减压干燥，依法测定。本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱（光谱集600）一致。五、色谱法（一）高效液相色谱法ChP2010尼莫地平片的鉴别：在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。（二）薄层色谱法BP2010硝苯地平的鉴别：取本品加甲醇制成每1ml中约含1mg的溶液，作为供试品溶液；另取硝苯地平对照品适量，加甲醇制成每1ml约含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各5ul，分别点于同一硅胶F254薄层板上，以乙酸乙酯-环己烷（40∶60）为展开剂，展开，晾干，置紫外光灯（254nm）下检视，供试品溶液所显主斑点的位置和颜色应与对照品溶液的主斑点一致。第三节有关物质的检查二氢吡啶类药物遇光极不稳定，易发生光化学歧化作用，引入杂质，因此各国药典标准中均规定在避光条件下进行有关物质检查，大多采用HPLC法。HNCH3CH3CH3OOCCOOCH3NO2NCH3CH3CH3OOCCOOCH3NO2[O]或光NCH3CH3CH3OOCCOOCH3NO光硝苯地平在光照和氧化剂存在条件下分别生成两种降解氧化产物：杂质I：2,6-二甲基-4-(2-硝基苯基)-3,5-吡啶二甲酸二甲酯杂质II：2,6-二甲基-4-(2-亚硝基苯基)-3,5-吡啶二甲酸二甲酯ChP2010硝苯地平有关物质的检查：避光操作。取本品，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，作为供试品溶液；另取2,6-二甲基-4-(2-硝基苯基)-3,5-吡啶二甲酸二甲酯(杂质Ⅰ)对照品与2,6-二甲基-4-(2-亚硝基苯基)-3,5-吡啶二甲酸二甲酯(杂质Ⅱ)对照品，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中各约含10μg的混合溶液，作为对照品贮备液；分别精密量取供试品溶液与对照品贮备液各适量，用流动相定量稀释制成每1ml中分别含硝苯地平2μg、杂质Ⅰ1μg与杂质Ⅱ1μg的混合溶液，作为对照溶液。对照高效液相色谱法试验。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(60:40)为流动相；检测波长为235nm。取硝苯地平对照品、杂质Ⅰ对照品与杂质Ⅱ对照品各适量，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中各约含1mg、10μg与10μg的混合溶液，取20μl，注入液相色谱仪，杂质Ⅰ峰、杂质Ⅱ峰与硝苯地平峰之间的分离度均应符合要求。取对照溶液20μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使硝苯地平色谱峰的峰高约为满量程的50%；再精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液的色谱图中如有与杂质Ⅰ峰、杂质Ⅱ峰保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，均不得过0.1%；其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液中硝苯地平峰面积（0.2%）；杂质总量不得过0.5%。第四节含量测定一、铈量法NHNO2CO2CH3CH3CH3H3COO2Ce(SO4)26HClO4NNO2CO2CH3CH3CH3H3COO2Ce(ClO4)34H2SO4硝苯地平与硫酸铈反应的摩尔比为1∶2。终点时:微过量的Ce4+将指示剂中的Fe2+氧化成Fe3+，使橙红色配合物离子呈淡蓝色或无色，以指示终点的到达。ChP2010硝苯地平的含量测定：取本品约0.4g，精密称定，加无水乙醇50ml，微热使溶解，加高氯酸溶液（取70%高氯酸8.5ml，加水至100ml）50ml、邻二氮菲指示液3滴，立即用硫酸铈滴定液（0.1mol/L）滴定，至近终点时，在水浴中加热至50℃左右，继续缓缓滴定至橙红色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml硫酸铈滴定液（0.1mol/L）相当于17.32mg的C17H18N2O6。二、紫外-可见分光光度法ChP2010尼群地平软胶囊的含量测定：避光操作，取本品10粒置小烧杯中，用剪刀剪破嚢壳，加无水乙醇少量，振摇使溶解后，将内容物与嚢壳全部转移至具塞锥形瓶中，用无水乙醇反复冲洗剪刀及小烧杯，洗液并入锥形瓶中，将锥形瓶密塞，置40℃水浴中加热15分钟，并时时振摇，将内容物移入100ml量瓶中，用无水乙醇反复冲洗嚢壳和锥形瓶，洗液并入量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置100ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，在353nm的波长处测定吸光度；另取尼群地平对照品适量，精密称定，用无水乙醇溶解并定量稀释制成1ml中约含20μg的溶液，同法测定，计算，即得。三、高效液相色谱法ChP2010尼莫地平分散片的含量测定：色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（35∶38∶27）为流动相；检测波长为235nm。理论板数按尼莫地平峰计算不低于8000，尼莫地平峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。测定法避光操作。取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于尼莫地平10mg)，置50ml量瓶中，加流动相适量，超声处理15分钟使尼莫地平溶解，放冷，用流动相稀释至刻度，摇匀，离心10分钟(每分钟3000转)，精密量取上清液5ml，置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取尼莫地平对照品，精密称定，用流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含20ug的溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。第五节体内二氢吡啶类药物的分析氨氯地平分子结构中含有一个手性碳原子，故具有一对光学异构体R-(+)-氨氯地平与S-(-)-氨氯地平，仅S-(-)-氨氯地平具有血管扩张作用，其中左旋氨氯地平药效是消旋氨氯地平的2倍，因此需进行血浆中氨氯地平对映体的手性分离与立体选择性药动学研究。人血浆中氨氯地平对映体的固相萃取LC-MS/MS法测定：样品处理：血浆样品1.0ml，与1.0ml用流动相制备的内标溶液(10ng/ml)混合后，取1.8ml上载至C18固相萃取柱(萃取柱预先用含2.5%氨的甲醇1.0ml洗涤2次，再用5mmol/L醋酸铵溶液1.0ml冲洗平衡)，分别用5mmol/L醋酸铵溶液1.0ml和水-甲醇(65:35)1.0ml洗涤，再用含2.5%氨的甲醇1.0ml洗脱，洗脱液在60℃下于旋转蒸发器上蒸发至干，残渣物加250µl流动相溶解，吸取100µl注入液相色谱-质谱联用系统进行分析。色谱与质谱条件色谱柱为Chiral-AGP柱(150mm×4.0mm，5µm)，流动相为10mmol/L醋酸铵缓冲液(pH4.5)-正丙醇(99:1)，流速0.9ml/min，柱温30℃。APCI离子源，温度350℃，辅助气(N2)流速2L/min，气帘气(N2)压力410kPa流速1.2L/min，电晕放电电流2A，正离子选择反应监测(SRM)[M+H]+离子，N2碰撞能量15eV，用于定量分析的离子反应分别为m/z409→238(氨氯地平)和m/z260→116(S-(-)-普萘洛尔)。SRM氨氯地平的LC-MS/MS离子流图A.空白血浆B.空白血浆添加0.5ng/ml的氨氯地平消旋体练习与思考题1.尼莫地平具有氧化性，与亚铁盐反应，呈现的颜色变化是A.溶液变为白色B.出现沉淀，沉淀由灰绿色变为红棕色C.溶液显橙红色D.出现橙红色沉淀E.无变化2.各国药典规定对二氢吡啶类药物中引入的杂质检查大多采用的方法是A.TLCB.紫外分光光度法C.比色法D.HPLCE.IR3.ChP2010的二氢吡啶类药物原料药均采用何种方法测定含量A.TLCB.紫外分光光度法C.铈量法D.HPLCE.非水溶液滴定法4.ChP2010收载的尼莫地平软胶囊采用何种方法测定含量A.TLCB.紫外-可见分光光度法C.铈量法D.HPLCE.非水溶液滴定法•答案：1.B2.D3.C4B1.二氢吡啶类药物的共同特征是均含有的母核。2.二氢吡啶类药物的苯环硝基具有性，在酸性下被锌粉还原为，可用重氮化-偶合反应鉴别。