第七章生物信息学与生物芯片技术..

第七章生物信息学与生物芯片2主要内容§7.1基因芯片原理与应用§7.2蛋白质芯片原理与应用3生物芯片技术是20世纪90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。41995年秋天，在斯坦福大学做博士后的MarkSchena(M.谢纳）等人在Science杂志上发表论文，第一次成功地应用了基因芯片技术对拟南芥的基因表达进行了分析。标志着基因芯片进入了广泛应用的新阶段。MarkSchena,DariShalon,RonaldW.Davis,andPatrickO.Brown.QuantitativeMonitoringofGeneExpressionPatternswithaComplementaryDNAMicroarray.Science,1995:467-470.5生物芯片:是将生物分子(寡聚核苷酸、cDNA、基因组DNA、多肽、抗原、抗体等)固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、尼龙膜等固相介质上形成的生物分子点阵。生物芯片技术是生命科学研究中继基因克隆技术、基因自动测序技术、PCR技术后的又一次革命性技术突破。6生物芯片基因芯片蛋白质芯片生物芯片的特点：1）高度集成2）微型化3）自动化4）快速§7.1基因芯片原理与应用8一、基因芯片基本原理•基因芯片（genechip），又称DNA微阵列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，其工作的基本原理是通过杂交检测信息。•基因芯片把大量已知序列探针集成在同一个基片上，经过标记的若干靶核酸序列通过与芯片特定位置上的探针杂交,便可根据碱基互补匹配的原理确定靶基因的序列。9DNA微阵列（microarray）1011Affymetrix公司（昂飞）由美国著名科学家斯蒂文•弗尔多博士(StephenFodor)在1992年创办,总部位于美国加利福尼亚州硅谷。公司于1996年在美国纳斯达克(NASDAQ)上市。公司在加州首府Sacramento、Emeryville、波士顿、英国伦敦、日本东京、新加坡都设有分部。昂飞是生物芯片产业的先驱，公司长期与美国国立卫生研究院、斯坦福大学、麻省理工、哈佛、耶鲁、加州大学伯克利等世界知名院校和研究所合作,在生物芯片行业中始终处于国际领先地位。美国昂飞公司博奥生物中国最好的芯片公司14mRNA表达谱芯片服务内容：39个物种15上海伯豪生物（一）基因芯片设计•提出基因芯片要解决的问题，确定研究目标。•根据所选择的基因序列，设计探针阵列，确定每个探针以及探针在芯片上的排列。二、基因芯片工作基本步骤17•根据探针的类型和长度，基因芯片可分为两类。•其中一类是较长的DNA探针（100mer）芯片–这类芯片的探针往往是PCR的产物，通过点样方法将探针固定在芯片上，主要用于mRNA的表达分析。•另一类是短的寡核苷酸探针芯片–其探针长度为25mer左右，一般通过在片（原位）合成方法得到，这类芯片既可用于mRNA的表达监控，也可以用于核酸序列分析。18根据探针标记方法，基因芯片也可分为两类1）同位素标记探针32P、33P2）非同位素标记探针生物素、地高辛19•一是在片合成法在片合成法是基于组合化学的合成原理。在片合成法制备DNA芯片的关键是高空间分辨率的模板定位技术和固相合成化学技术的精巧结合。•另一种方法是点样法首先按常规方法制备cDNA（或寡核苷酸）探针库，然后通过特殊的针头或微喷头,分别把不同的探针溶液，逐点分配在固相基底表面上的不同位点,并通过物理或化学的结合使探针被固定于芯片的相应位点。（二）基因芯片的制备（主要有两种基本方法）20（三）样品制备及芯片杂交根据基因芯片的检测目的不同,可以把样品制备方法分为：1）用于表达谱测量的mRNA样品制备2）用于多态性(或突变)研究的基因样品的制备21杂交：检测过程平行化，可以同时检测成百上千的基因序列，而且由于集成的显微化，使得杂交所需的探针及待检测样品均大为减少，杂交时间明显缩短，一般的分子杂交过程可在30分钟内完成。常规：1）杂交时间长4-24h2）样品处理数量少（1-几个）22（四）杂交信号检测•对于用荧光素标记经扩增（也可用其他放大技术）的序列或样品，与芯片上的探针进行杂交，然后冲洗，采集荧光图像。•图像的采集用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、激光扫描仪、半导体传感器等进行。23三、生物信息学在基因芯片中的应用•生物信息学在基因芯片中的应用主要体现在三个方面:–确定芯片检测目标–芯片设计–实验数据管理与分析24（一）药物筛选和新药开发由于所有药物（或兽药）都是直接或间接地通过修饰、改变人类（或相关动物）基因的表达及表达产物的功能而生效，而芯片技术具有高通量、大规模、平行性地分析基因表达的能力，在药物筛选方面具有巨大的优势。用芯片作大规模的筛选研究可以省略大量的动物试验甚至临床，缩短药物筛选所用时间，提高效率，降低风险。四、基因芯片的应用25（二）疾病诊断基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。采用基因芯片技术，疾病的早期诊断率将大大提高，而误诊率会大大降低，同时有利于医生综合地了解各个系统的疾病状况。26（三）环境保护在环境保护上，基因芯片也广泛的用途，一方面可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害，同时也能够通过大规模的筛选寻找保护基因，制备防治危害的基因工程药品、或能够治理污染源的基因产品。（四）司法如果建立全国甚至全世界的DNA指纹库，可直接在犯罪现场对疑犯留下来的头发、唾液、血液、精液等进行分析，并与DNA指纹库系统进行比较，以快速、准确地破案。目前，科学家正着手于将生物芯片技术应用于亲子鉴定中，应用生物芯片后，鉴定精度将大幅提高。27基因芯片技术可以用来筛选农作物的基因突变，并寻找高产量、抗病虫、抗干旱、抗冷冻的相关基因，也可以用于基因扫描及基因文库作图、商品检验检疫等领域。目前该类市场尚待开发。（五）现代农业28（六）研究领域一组寡核苷酸探针—TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由杂交位置确定的一组核酸探针序列GTTAGATC杂交探针组TATGCAATCTAG重组的互补序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATCATACGTTA1测定未知序列292DNA序列突变检测分析有两种方法可以进行已知突变点的分析:•一种方法是对于目标序列上已知的突变点，以该点为中心，从目标序列选取一个片段，作为设计探针的参考序列。根据参考序列，分别设计四个高度特异的探针，这四个探针除中心位置外均相同并与参考序列互补。•另一种方法是对于目标序列上已知的突变点，分别设计四组探针，其中每一组探针分别检测一种核苷酸替换。同一组中的各个探针长度相同，相互之间交叠，并且每个探针均覆盖对应的突变点。30313SNP分析•同一物种的不同个体基因组约有99.9％相同，正是0.1％的不同才体现了个体的差异或多样性。单核苷酸多态性（SNP)：是指基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基，其中最小一种在群体中的频率不小于1％。人-3％0.1％序列变化—1％---改变蛋白质功能—900个基因产物不同。与生物进化历程、种族关系、疾病发生相关。324、基因表达分析•基因表达是以基因的DNA为模板进行mRNA转录和蛋白质翻译合成的过程，各种基因的表达存在差异，一种组织中不同基因表达水平的差异可达1万倍。功能基因研究的一种重要的方法就是采用高通量基因表达检测技术，全面分析基因的表达水平，了解基因的功能。33345、寻找新基因在缺乏任何序列信息的条件下，基因芯片也可用于基因发现。如HME基因和黑色素瘤生长刺激因子就是通过基因芯片技术发现的。目前，大量涌现的人类ESTs给cDNA微阵列提供了丰富的序列资源，数据库中ESTs代表了人类基因，因此ESTs微阵列可在缺乏其它序列信息的条件下用于基因发现和基因表达检测，从而加快人类基因组功能分析的进程。§7.2蛋白质芯片原理与应用36蛋白质芯片的提出•DNA芯片的成功证明了生物芯片是可行的DNA芯片对医学与生物学研究产生了巨大影响DNA芯片成为研究活体基因组的强有力工具•DNA芯片不能作为蛋白质检测的直接依据mRNA与蛋白质表达水平不直接相关•蛋白质组计划需要一种新的蛋白质分析技术37尽管还存在许多问题,2000年秋天,Schreiber小组展示了他们可以制造高密度蛋白质芯片并且保持蛋白质成键能力的技术。38蛋白芯片技术的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片；然后，用标记了特定荧光抗体的蛋白质或其他成分与芯片作用，经漂洗将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去；再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋白质功能的目的。一、蛋白质芯片基本原理蛋白质固定（探针）杂交扫描成像或进行质谱分析蛋白质功能鉴定39401）保持蛋白质的活性。2）保证蛋白质正确定位。3）与现存的mRNA芯片研究工具要相兼容。4）缺乏与PCR等价的蛋白质扩增技术，因而对低丰度蛋白质的检测是蛋白质芯片技术的极大挑战。蛋白质芯片要解决的问题：41蛋白质活性保持在制备芯片过程中,为了保证被固定在载体上的蛋白质依然保持天然的构象和生物学活性,他们在蛋白质点样的磷酸缓冲液（PBS)中加入40%的甘油,以防止因液体的蒸发而造成的蛋白质变性。42弹性蛋白模拟物亮氨酸链蛋白质固定化学表面型蛋白质芯片和生物表面型蛋白质芯片。化学表面芯片又可分为疏水型、亲水型、弱阳离子、强阴离子、金属离子螯合、特异结合等，以适用检测不同情况下蛋白表达。生物表面芯片人又可分为抗原-抗体、受体-配体、DNA－蛋白质、酶等芯片。43二、蛋白质芯片的应用蛋白质芯片技术具有快速、并行、自动化和高通量的特点,它能同时对全基因组水平的上千种不同蛋白质进行分析,是蛋白质组研究的重要手段。目前已经广泛应用于蛋白质表达谱的分析、蛋白质功能及蛋白质-蛋白质间相互作用的研究、临床疾病(如肿瘤等)的诊断和疗效评价、药物新靶点的筛选和新药的研制等各个领域。441、蛋白质研究方面的应用蛋白质芯片技术目前是蛋白质组学研究中最具有应用前景的一项技术。1）氨基酸序列测定（与质谱联用）。2）差异表达蛋白的筛选鉴定。452研究蛋白质的相互作用包括蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-RNA相互作用、蛋白质-DNA相互作用463、临床方面的应用蛋白质芯片技术在临床方面有着广泛的应用。尤其是在疾病的诊断和疗效判定,即生物学标志物的检测上,蛋白质芯片技术具有很大的应用价值和前景。建立疾病的蛋白质表型指纹(phenomicfingerprint)。利用疾病的表型指纹库,我们便可以对各种疾病进行诊断。疾病的蛋白质表型指纹：某一疾病组织与健康组织在蛋白质表达量方面的差异。474、新药研制方面的应用受体蛋白固定于芯片候选药物荧光标记杂交确定新药48三、问题和前景1）首先是成本问题2）蛋白质芯片在制作过程中实验条件发生微小的变化便可能引起最后结果的不同,实验条件不易控制,使得实验结果的可重复性相对不足。49考试题型1、名词解释2、填空题3、选择题4、简答题5、论述题注：1）开卷考试、独立完成！2）认真复习、争取优异成绩！