丛枝菌根中的真菌脂质几丁寡糖共生信号

Fungallipochitooligosaccharidesymbioticsignalsinarbuscularmycorrhiza（丛枝菌根中的真菌脂质几丁寡糖共生信号）Page2期刊介绍NATURE卷:469期:7328页:58-U1501DOI:10.1038/nature09622出版年:JAN62011出版商NATUREPUBLISHINGGROUP,MACMILLANBUILDING,4CRINANST,LONDONN19XW,ENGLAND研究方向:Science&Technology-OtherTopics类别:MultidisciplinarySciences文献类型:Article语种:English入藏号:WOS:000285921600030PubMedID:21209659ISSN:0028-0836Page3背景介绍丛枝菌根(arbuscularmycorrhiza,AM)真菌是一类古老的微生物,其与植物共生的历史可追溯到4.6亿年前。AM是陆生生物与古门球囊菌门真菌之间的一种根内共生。与AM真菌共生能促进植物水分、养分的吸收,增强植物对生物及非生物胁迫的抗性;作为回报,共生植物反馈AM真菌碳水化合物,以帮助真菌完成生活史。Page4人们对AM真菌与植物共生关系的研究已跨越百年。目前,绝大多数研究集中于共生关系形成之后,而调控植物与真菌共生关系形成的相关信号物质研究较少。最近有证据表明AM真菌能产生一些可扩散的信号。本文将说明Glomusintraradices（丛枝菌根真菌）能分泌使生成AM的混合的硫酸盐和非硫酸盐的lipochitooligosaccharides(LCOs脂质几丁寡糖)生物共生信号。而在豆科Medicagotruncatula（苜蓿）植物中，这些信号能通过DMI信号通路刺激根系的生长和分支化。背景介绍Page5实验对象1.活性确定对象：a:theViciasativaroot-hairbranchingassay(VsHab豌豆根毛分支法),它能检测不同类型的非硫酸盐化的LCOs。b：包含早期节瘤基因MtENOD11启动因子区域和GUS受体基因的Medicagotruncatula（苜蓿）转基因株(ENOD11法)。它能检测不同类型的硫酸盐化LCOs.c:Medicagotruncatula分支根系，用于Myc信号的检测。2.分离对象：a：G.intraradices侵染的胡萝卜根的无菌分泌物b；无AM菌感染的胡萝卜根无菌分泌物c:G.intraradices的发芽孢子提取物（GSE）Page6实验部分——G.intraradices分泌LCOs用正丁醇和乙酸乙酯对G.intraradices侵染的胡萝卜根的无菌分泌物进行提取。提取物用HPLC初步分离。分离物中部分A（F4、F5）（40%乙腈洗脱得到）检测到对ENOD11有生物活性，部分B（F9、F10）（60%乙腈洗脱得到）检测到对VsHab有生物活性。并且2个部分都能促进苜蓿根的分支化，说明AM真菌能分泌可传播的因子。Page7实验部分——G.intraradices分泌LCOs将部分A、B做UPLC/Q-ToFMS谱。部分A在负离子电喷雾模式下，有12个硫酸盐化LCOs的分子离子拥有m/z值，其中6个分子离子（m/z值为1,105.5,1,103.5,1,101.5,1,133.5,1,131.5,1,129.5）对应于硫酸盐化的四聚体LCOs(LCO-IV,S)，被拥有0、1、2个不保护度的C16或C18脂肪酸链N-酰化。另外6个分子离子（m/z值为1,308.6,1,306.6,1,304.6,1,336.6,1,334.6and1,332.6)对应于硫酸盐化的五聚体LCOs(LCO-IV,S)被同样的酰基链酰化。Page8实验部分——G.intraradices分泌LCOs为确定这些分子离子结构所做的UPLC/Q-ToFMS谱。得到了LOCs的代表性片段。Page9实验部分——G.intraradices分泌LCOs部分B在正离子模式下，检测到非硫酸盐化的LCO-IV(C16:0)和LCO-IV(C18:1)。在F1到F3中，我们没有检测到亲水性的LOCs,在F6到F8中，也没有检测到疏水性的LOCs。所以在菌根根中存在分泌物中存在硫酸盐化与非硫酸盐化的LCOs混合样品。在同样培养条件下的无AM菌感染的胡萝卜根无菌分泌物（GSE）中，通过高敏感性的LC/Q-Trap分析，没有检测到LOCs，支持了是AM菌分泌的LOCs这一推论。Page10实验部分——G.intraradices分泌LCOs为了证明这一点，也对G.intraradices的发芽孢子提取物进行了分析。它的丁醇提取物能够导致苜蓿根的分支化。提取物通过LC/Q-TrapMRM模式分析在部分B中，MRM的痕迹，LCO-IV的特性（C18：1（1,053.426，1,053.629，1,053.832;图2c）和LIV（C16：0）（1,027.400，1,027.603，1,027.806，数据未显示）Page11实验部分——G.intraradices分泌LCOs部分A也进行了相似的检测。检测到了硫酸盐化的LCOs.GSE中成分HPLC的保留时间和观测到的MRM痕迹能够对应于根据已在菌根分泌物中证明存在的LCOs所合成的Myc-LCOs。Page12实验部分——G.intraradices分泌LCOs棕榈酸（C16：0）和C18：1脂肪酸是AM菌的LCOs的主要N-酰基取代。为了确定C18：1取代基的结构，GSE中部分B的水解所得脂肪酸经行气质联用分析。并与合成的商业对照品经行保留时间和图谱的比较。Page13实验部分——Myc-LCOs刺激AM的合成M.truncatula幼苗在1:1的硫酸化和非硫酸化(Syn)Myc-LCOs(10nM)凝胶斜面的生长管中培养。并将之接种G.intraradices孢子。每株植物感染单位的数量（含有分离区域丛枝和内部菌丝网络，图4a）Myc-LCOs处理后根的长度和每平方厘米感染密度都大大增加。Page14实验部分——Myc-LCOs刺激AM的合成我们检查了Myc-LOCs是否能够刺激M.truncatulagenes，其中涉及一些早期的相互作用。通过豆科模型根部转录分析可以确定被AM菌感染或存在真菌可扩散因子后，上百个基因得到了上调。在这些基因中，选择了10个。定量PCR反向转录显示，在10个测试基因中，用(Syn)Myc-LCO处理后，4个基因DMI3依赖性的上调了。这又是一项证明在AM真菌共生中，一些分子充当了信号。Page15实验部分——Myc-LCOs刺激AM的合成我们测试的Myc-LCOs在非豆科植物万寿菊孔雀草（菊科）和胡萝卜（伞形科）上的影响。对于孔雀草，植株用!:1的硫酸盐化和非硫酸盐化的(Syn)Myc-LCOs处理。发现它感染数量和每株感染单位。当植株用纯的硫酸盐化或非硫酸盐化或1:1混合的处理植株，结果用混合处理的根定植率加倍了(+104%)，而纯度非硫酸盐化和纯的硫酸盐化分别只增加了75%和42%。Page16实验部分——Myc-LCOs刺激AM的合成AM真菌在根的转化培养中能形成菌根。为了测试Myc-LCOs是否能够刺激切离的胡萝卜根进行根菌化，我们用根瘤菌突变体所产生的1:1混合的硫酸盐化与非硫酸盐化的(Rhi)Myc-LCO类似物。这些化合物掺入培养基中使得定植率极大增加(+68%)。而合成的1:1混合的硫酸盐化与非硫酸盐化(Syn)Myc-LCOs增加了20%。因此，根部响应这些Myc信号并不需要地上部分的存在。对于这3种植物来说，包括豆科和非豆科，合成的(Syn)Myc-LCOs都能够是AM生成，可能是通过刺激根的分支化和感染密度。这又是一有力证据证明我们确认的Myc-LCOs是真实的菌根信号。Page17实验部分——Myc-LCOs刺激根分支化在M.truncatula中，AM真菌分泌一些能刺激根分支化的可扩散的化合物。这种响应可以在基因水平上进行剖析。在HPLC的部分A与部分B中，有硫酸盐与非硫酸盐的LCOs,这些能够引起root-branchingstimulation(RBS)。为了确定这是否归因于LCOs并且不污染真菌化合物。我们分别测试了硫酸盐化或非硫酸盐化的(Syn)Myc-LCOs或它们1:1的混合物在浓度范围为10pM到10nM时对M.truncatula幼苗的影响。Page18实验部分——Myc-LCOs刺激根分支化非硫酸盐化的(Syn)Myc-LCOs在小于10nM的浓度可以引起RBS，而硫酸盐化的(Syn)Myc-LCOs和混合的(Syn)Myc-LCOs在小于0.1nM的浓度即可引起RBS，有的实验甚至小于0.01即可。硫酸盐化和非硫酸盐化的Myc-LCOs均有生理活性，但硫酸盐化的活性大约高100倍。Page19实验部分——Myc-LCOs刺激根分支化在M.truncatula中确定的共生信号通路包括：结瘤感知因子(NFPandLYK3)的基因编码、钙信号(DMI1,DMI2andDMI3)的基因编码、特异性结瘤转录因子(NSP1andNSP2)。这些基因都是nodulation（结瘤）所必须的，DMI1,DMI2andDMI3还是mycorrhization（菌根化）所必须的基因。除了刺激通过S.meliloti（根瘤菌）结瘤因子引起RBS的LYK3基因。而硫酸盐化的Myc-LCOs与S.meliloti（根瘤菌）结瘤因子有相似的结构。它引起RBS可能是通过结瘤信号通路：为了避免Nod和Myc通路可能交叉，我们首先测试了硫酸盐化的Myc-LCOs（at10nM).Page20实验部分——Myc-LCOs刺激根分支化RBS响应依赖于3个DMI基因。而响应独立于NSP1基因，这表明非硫酸盐化的Myc-LCOs不会通过结瘤通路触发RBS。而响应依赖于NSP2.因此我们重新定量评估了Myc基因在菌根形成的初期阶段表型。nsp2-2突变株显示出比野生型植物高度显著降低41％定植水平。说明NSP2基因在Myc信号化中。这表明非硫酸盐化的Myc-LCOs是通过Myc信号通路来引发RBS的。Page21实验部分——Myc-LCOs刺激根分支化从农学的角度看，调查Myc-LCOs在植物根的整个成长过程中的影响是比较重要的。为了避免由于路径串扰而可能出现的偏差。Page22讨论可扩散的Myc信号结构的发现是在我们对植物根内共生理解的一个里程碑。并且打开了许多剖析分子和细胞层面相互作用的可能性。而AM真菌G.intraradices分泌的硫酸盐化和非硫酸盐化混合的LOCs与rhizobialNodfactors.（根瘤菌结瘤因子）有类似的结构。我们所确定的Myc信号对应于以前提出的Myc因子的定义：1:它们通过DMI信号引起植物响应。2：在豆科植物中，在DMI3的下游激活路径中，NSP1是非依赖的。Page23