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非损伤微测技术证明胞外H+活性与肿瘤耐药相关DirectEvidencefortheCorrelationbetweenExtracellularH+ActivitiesandDrug-ResistanceofTumorCellsbyNon-invasiveMicro-testTechnique宋瑾1，唐勇2，PingZhang3，许越1,4SONGJin1,TANGYong2,ZHANGPing3,XUYue1,41非损伤微测技术测试中心，旭月(北京)科技有限公司，海淀区苏州街49-3,盈智大厦601，北京1000801CenterofNon-invasiveMicro-testTechnique,Xuyue(Beijing)Sci.&Tech.Co.,Ltd.,Beijing100080,China2北京中医医院，中国北京东城区美术馆后街23号，北京1101802BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineaffiliateofCapitalUniversityofMedicalSciences,Beijing110180,China3耶鲁大学医学院，细胞和分子生理学系，纽黑文市，CT06520，美国3DepartmentofCellularandMolecularPhysiology,SchoolofMedicine,YaleUniversity,NewHaven,CT06520,USA4马萨诸塞州立大学生物系，阿姆赫斯特市，MA01003，美国4DepartmentofBiology,UniversityofMassachusetts,Amherst,MA01003,USA通讯作者：许越，Email:jeffxu@youngerusa.com，电话：010-82622628，传真：010-82622629-1-中文摘要：本文介绍了人乳腺癌细胞（药物敏感株:MCF-7/S及耐药株:MCF-7/R）在化疗药物阿霉素(ADR:Adriamycin)处理下细胞外pH和H+流动方向和速率的变化。为此，我们建立了一个基于非损伤微测技术(NMT:Non-invasiveMicro-testTechnique)的药物抗性研究平台(DRSP:DrugResistanceStudyPlatform)，该平台可用于研究器官/组织/细胞外离子/分子活性与肿瘤细胞耐药性之间的相互关系。结果显示存在一个贯穿实验，并以固有振荡形式出现的胞外H+流现象。此外，耐药株净H+流在加ADR前趋近于零，而敏感株净H+流呈明显内流。敏感株和耐药株加ADR后净H+均呈外流，但耐药株的净H+外流速率要高于敏感株3倍。与净H+流动速率结果相一致的是胞外的pH也产生了相应的变化。因此，本实验为胞外H+活性与肿瘤耐药性的相互关联提供了直接证据。中文关键词：非损伤微测技术；H+浓度及流动速率；MCF-7肿瘤细胞；化疗药物耐药0引言无论是正常细胞还是肿瘤细胞，细胞内pH（pHi）是细胞维持各种生理功能的重要参数。为维持pHi的稳定，细胞在产酸和泌酸之间存在着动态平衡。实体瘤的重要特点之一是细胞间质呈酸性。磁共振光谱法(MagneticResonanceSpectroscopy,MRS)揭示，肿瘤细胞的“Warburg效应”使肿瘤细胞比正常细胞产生更多的酸，但对肿瘤细胞检测发现pHi值较正常细胞无明显区别，而细胞外pH(pHe)和细胞内酸性囊泡内的pH(pHv)明显低于正常细胞，提示可能与肿瘤细胞有较强的泌酸功能有关[1]。调节药物进入细胞的主要机制是细胞内外的pH梯度差。在正常细胞中，pHe基本上是中性的，pHi是偏酸的，这使得弱碱性的药物被动进入细胞。绝大多数化疗药物均为弱碱性电解质，在体液内均有不同程度的解离。分子状态(非解离型)药物疏水而亲脂，易通过细胞膜；离子状态药物极性高，不易通过细胞膜的脂质层，这种现象称为离子俘获(iontrapping)。弱碱性的药物在酸性环境中易于离子化，因此，肿瘤细胞较低的pHe能够降低一些化疗药物的效果。其他一系列的机制亦与此相关，包括酸化降低了细胞周期中处于分裂状态的细胞数，产生了选择性的凋亡抵抗表型和由离子梯度决定的药物分布或离子俘获[2,3]。离子俘获模型预测，弱碱性化疗药物，如阿霉素、柔红霉素和长春新碱在酸性环境中将离子化并聚集在更加酸化的区室中，因此，肿瘤的酸性pHe将有效地阻断药物进入细胞或中和药物以及将药物隔绝在酸性的细胞囊泡中以阻止到达它们细胞内的作用靶点，从而降低其对肿瘤细胞的杀伤作用[4]。研究者还观察到遗传背景相-2-同的耐药肿瘤细胞株和药物敏感细胞株细胞内外的pH值差别及其变化对耐药性的影响：在pHe值降低时，耐药株能保持pHi的稳定，而药物敏感株pHi容易随pHe的降低而降低，提示药物敏感株调节pH的质子泵V-ATPase的活性较低、pHi易随pHe而变化，而耐药株对pHi的稳定有较强的调节力[5]。进一步研究证明，肿瘤细胞内外的pH梯度差并未改变化疗药物的内流数量，而是改变了药物在细胞内外的分布[6]。非损伤微测技术或称无损微测技术，是一种选择性离子/分子微电极技术。非损伤微测技术以其特有的非损伤性测量方式逐渐被广泛应用到基础生物学、生理学、神经生物学、环境科学、药理学、材料科学等诸多领域。目前，非损伤微测技术不但可以测量H+,Ca2+,K+,Na+,Cl-,NO,O2,H2O2及温度等参数，而且可以同时采集多种离子/分子参数，为获得生物样品分子或离子运动的有关信息提供了良好的实验平台[12]，其系统组成示意图见图1。图1利用非损伤微测技术的非损伤性特点[7-12]，我们建立了一个药物抗性研究平台。通过实时检测阿霉素（ADR）敏感株及耐药株乳腺癌细胞的pHe及H+流，从而验证这些值与乳腺癌细胞对抗肿瘤药物阿霉素的耐药性的相关性。同时，期望能够找到pHe及动态H+活性（流速、方向、振荡方式）作为肿瘤细胞对化疗药物耐药的指纹性指标。1材料和方法1.1细胞培养人乳腺癌细胞ADR敏感株MCF-7/S及耐药株MCF-7/R由首都医科大学附属北京中医医院中心实验室提供。使用高糖DMEM培养基，含10%小牛血清和双抗（青霉素100μgml-1、链霉素100μgml-1），置37℃、5%CO2的恒温箱中传代培养。1.2非损伤微测技术及氢离子选择性电极使用非损伤微测系统(BIO-001A,YoungerUSASci.&Tech.Corp.,USA)以静态和动态的方式选择性地测定离子浓度。选择性微电极在预先确定距离（5–30μm）的两点间重复运动，从而测得特定离子的绝对浓度或浓度梯度，微电极的运动频率可通过编程设定在0.01–10.00Hz范围内，对于大多数微电极通常设定于0.3–0.5Hz的范围内。测定H+浓度和流速所用非损伤微电极（XY-H-01型）由旭月（北京）科技有限公司提供。H+选择性微电极前端灌充有15～25μm选择性的氢离子的液态交换剂（LIX）-3-(HydrogenIonophoreI-cocktailB,no.95293;Fluka,BuchsSG,Switzerland)，其后灌充有10mm左右的电解液柱（40mmolL-1KH2PO4和15mmolL-1NaCl,pH7.0）。将电极固定器(EHB-1;WorldPrecisionInstruments)上的Ag/AgCl丝从电极后面插入，使其与电解液接触。接地参比电极（DRIREF-2;WorldPrecisionInstruments）为固体电极。1.3氢离子选择性微电极的校正及氢离子活性的检测H+选择性微电极在使用前必须经过校正，只有能斯特斜率（Nernstianslopes）56mv/decade的电极才可使用，校正液为pH5.5和pH6.5的PBS缓冲液。检测时将MCF-7及MCF-7/R细胞的DEME培养液换为PBS缓冲液，以dr=10μm的移动距离，在垂直于培养皿底的方向上对细胞的H+流进行检测，电极距离细胞2μm左右，将测试液更换为含10μgml-1阿霉素（ADR）的PBS后，检测相同的细胞，对比加药前后MCF7细胞外氢离子活性变化。2结果利用非损伤微测技术能够在不接触样品的情况下实时检测进出样品离子流速、方向及离子浓度的信息，并可持续一定时间（最长可达几个小时），我们在获得乳腺癌细胞（MCF-7/S及MCF-7/R）pHe（见图2B）的同时，也获得了跨膜H+流的实时动态信息（见图2A）：1.耐药株和敏感株加药前后H+的内流或外流均呈现振荡的特征，且振荡的幅度和频率不尽相同；2.耐药株和敏感株加药后H+均呈现外流，但耐药株的H+外流速率明显高于敏感株，而两者的pHe也相应降低，且耐药株降低幅度明显大于敏感株。图2分别对耐药株及敏感株5个细胞所测得的H+流变化进行数理统计（图3）。耐药株加药前净H+流接近零，加药后H+强烈外流，均值为34.7picomolescm-2s-1；敏感株加药前净H+流呈明显内流（-17.4picomolescm-2s-1），加药后H+转为外流（7.5picomolescm-2s-1）。图3-4-3讨论目前研究表明，细胞内外pH值的改变在细胞耐药性上发挥一定作用，如米托蒽醌耐药的MCF-7／Mitox细胞及阿霉素耐药的MCF-7／D40细胞内外pH梯度随肿瘤细胞体积的增大而增加，而敏感株MCF-7／S细胞则没有表现出这种现象，说明pH梯度的增加有助于耐药肿瘤细胞将弱碱性药物排出细胞，并可通过监测细胞质子的流动、pH值的改变来检测肿瘤细胞的抗药性[5]。本文初步建立了基于非损伤微测技术的药物抗性研究平台(DRSP)，通过该平台实时监测MCF-7/S及MCF-7/R细胞外H+活性，得到了较为丰富的胞外H+活性信息，包括pHe的变化、细胞外流或内流H+的流速、H+流的振荡频率和振幅等指标，从不同侧面反应了施以化疗药物时细胞本身H+跨膜转运活力的变化。参与H+跨膜的离子泵有V-ATPase、H+-K+交换、H+-Na+交换等，利用非损伤微测技术能够同时检测两种离子的功能，未来可以实现H+-K+、H+-Na+同时研究，将为肿瘤细胞耐药性及多药耐药性机理的研究提供新的数据。进一步地，还可以应用非损伤微测技术检验其它离子/分子，如：K+、H+、Na+、Ca2+、O2、H2O2、NO等的活性与癌细胞耐药的相关性。4致谢感谢北京市海淀科委无偿资助(k200695)及中关村科技园区海淀园国际科技合作项目（2007国际科技合作07）的资助。感谢中国科学院植物研究所匡廷云院士、中国科学院生物物理所杨福愉院士、北京大学医学院林克椿教授对本项目的一贯支持。感谢军事医学科学院放射医学研究所王玉芝研究员、北京大学生命科学学院王世强教授、清华大学第一附属医院税朝祥副研究员、军事医科院附属医院肿瘤科鲍云华教授给予的专业建议。感谢Dr.JosephG.Kunkel1,DepartmentofBiology,UniversityofMassachusetts,Amherst,MA01003,USA和Dr.MichaelTytell,WakeForestUniversitySchoolofMedicineandNorthCarolinaBaptistHospitals,NorthCarolina,USA的有益探讨。5参考文献：[1]IzumiH,TorigoeT,IshiguchiH,UramotoH,YoshidaY,TanabeM,IseT,MurakamiT,YoshidaT,NomotoM,KohnoK.CellularpHregulators:potentiallypromisingmoleculartargetsforcancer-5-chemotherapy.CancerTreatmentReviews,2003,29(6):541.[2]NewellK,FranchiA,PouyssegurJ,TannockI.StudieswithGlycolysis-DeficientCell