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L/O/G/O农药残留快速检测技术学习目标•掌握速测卡法和分光光度法快速检测食品中有机磷及氨基甲酸酯类农药的基本原理及基本技能；•熟悉有机磷及氨基甲酸酯类农药的免疫分析检测方法；•了解熏蒸剂的检测意义及方法。农药概况：•农药是指用于农业、林业中各种药剂的统称。•特点：高效、快速和使用简便•危害：本身的毒性危害农药残留所引起的食品安全问题农药残留所引起的抗药性问题农药残留所引起的环境污染•按化学结构分类：有机氯类有机磷类氨基甲酸酯类拟除虫菊酯类农药检测现状：•随着食品中农药残留最高限量标准不断降低，检测难度越来越大，对检测技术的要求也越来越高。这就需要有相应的检测技术与之相匹配，尤其是快速检测技术。•与日本严格的农药残留标准相比，中国的标准相对较少。农残检查超标前5名农药，中国都未作农残限量规定；•与欧、美等都相差甚远，欧盟农残限量指标28689个，美国农残限量指标7400个。因此，必须适应国际新形势，制定合理的残留新标准。常用农药的分类及性质•有机磷农药特点：药效高、毒性大、易降解、广谱，成为目前农药生产中吨位最大，也是世界上生产和使用最多的农药品种。•图3-1有机磷农药结构通式•有机磷农药是典型的酶毒剂，可以通过消化道、皮肤、粘膜、呼吸道吸收。•毒理：对神经突触后膜上的乙酰胆碱酯酶活性的抑制，使酶不能催化乙酰胆碱水解，导致组织中乙酰胆碱过量蓄积。乙酰胆碱传导介质代谢紊乱，可导致迟发性神经毒性，引起运动失调、昏迷、呼吸中枢麻痹、瘫痪甚至死亡。常用农药的分类及性质•氨基甲酸酯类农药(NMCs)是继有机磷之后出现的一类农药。•NMCs的结构特性是含有一个N-甲基基团，为白色晶体，难溶于水，易溶于丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙腈等，碱性和高温条件下很易被水解。•具有杀虫效力强、作用迅速等特点。它的最大优点是在植物中只短暂停留，施用后很短的时间内就可被降解成相应的代谢产物，这些代谢产物通常具有与母体化合物相同或更强的活性。•20世纪70年代以来，由于有机氯农药受到禁用或限用，以及抗有机磷杀虫剂的昆虫品种日益增多，因而NMCs的用量逐年增加，这就使得NMCs的残留情况倍受关注。食品安全快速检测超临界萃取（SCFE）•常用农残快检方法•1、酶抑制法•2、免疫分析法•3、生物传感器法•要求：快速、灵敏、便捷•意义：作为实验室检测的辅助方法，对大量样品加以定性筛选，以减少送实验室定量检测的压力。农药残留快速检测方法：•1、酶抑制法：利用农药对胆碱酯酶的抑制作用，加入特定的显色剂，通过颜色深浅的变化确定是否有农药残留或农药残留相对量的快速检测方法。•特点：造价不高，试剂生产已成规模，稳定性好，操作简便、速度快，特别适宜现场检测或对大批量样品的筛查，目前普遍使用。•关键：如何选择酶源•酶源：来自动物的胆碱酯酶从植物中提取的植物酯酶动物酶原：超临界萃取（SCFE）•胆碱酯酶广泛存在于动物的组织中。目前主要集中在动物肝脏和血液，如猪肝，鸡血等•也有利用蚯蚓以及海洋鱼类，甲壳类动物的神经组织、脑组织分离乙酰胆碱酯酶。•1953年stedman等首先从马血清中分离出乙酰胆碱酯酶动物酶原：•从昆虫提取，如：家蝇、麦二叉蚜、黄猩猩果蝇、烟草天蛾、光叶库蚊、黄粉甲、美洲淤夜蛾、豆荚草盲蝽、马铃薯叶甲、骚扰角蝇及棉铃虫等。超临界萃取（SCFE）•以从敏感家蝇中提取的乙酰胆碱酯酶效果最佳，研究表明，家蝇羽化后2-3天时其头部的乙酰胆碱酯酶敏感性最高。•不足：保持期短，需冷冻低温保存。动物酶原：超临界萃取（SCFE）原理：乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱乙酸+胆碱↓5，5-二硫代-双-2-硝基苯甲酸5，5-二硫代-双-2-硝基苯甲酸（黄色）•在410nm处有最大吸收，测定其在单位时间内的生成量，即可测得乙酰胆碱酯酶的活性。通过测定乙酰胆碱酯酶(AChE)受抑制的程度来检测有机磷或氨基甲酸酯类农药。植物酶原：超临界萃取（SCFE）•植物酯酶特点：酶源丰富，提取和保存较为方便，只需以一定比例的水或缓冲液混合离心获得的上清液即可作为粗酶液，并在-4℃保存即可。测量准确度和精密度均不逊色。原理：植物酯酶乙酸萘酯乙酸+萘酚↓显色剂固蓝B偶氮化合物（紫红色）农药残留快检方法：•2、免疫分析法：高等动物都有免疫功能，当细菌、病毒和有害物等病原入侵时，能产生抵御外来物的抗体，这就是动物的免疫反应。•致病的外来物被称为抗原。免疫是机体识别和排除进入体内的抗原性异物的保护性反应。•免疫反应，即抗原抗体反应，不仅发生在生物体内，在体外亦能进行，而且反应是高度特异(即对特定结构的农药具选择性)，高度灵敏(可达pg/kg-mg/kg水平)。超临界萃取（SCFE）•农药免疫分析始于1968年，CentenoE.R等人制备了抗滴滴涕和马拉硫磷抗体，应用放射免疫法测定。•随后Sernberger.L.等人先后开发出狄氏剂、艾氏剂、苯菌灵、百草枯等农药的免疫分析法。•1981年，Ercegovich.R.等研制出对硫磷及2,4–滴和2,4,5–涕的放射免疫分析法(RIA)分析方法，检测限可达0.1g/kg。方法溯源：超临界萃取（SCFE）•局限性：大部分农药的残留量都可以使用气相色谱法等测定，该法并未比气相法更优越•人工合成抗原以及制备抗体的困难•免疫分析技术未被普遍重视。方法溯源：•免疫分析中的酶免疫分析法以其高度特异性和灵敏度，特别适合农药残留分析，故在80年代得到了快速发展。超临界萃取（SCFE）•酶联免疫具有专一性强、灵敏度高、快速、操作简单等优点，试剂盒可广泛用于现场样品和大量样品的快速检测，可准确定性、定量。方法溯源：•但由于受到农药种类多，抗体制备难度大、在不能肯定样本中的农药残留种类时检测有一定的盲目性以及抗体依赖国外进口等影响，酶联免疫法的应用范围受到较大的限制。超临界萃取（SCFE）•目前国外已研制出几十种农药的酶联免疫试剂盒，对于免疫分析技术在农药快速检测中的应用研究十分活跃，包括有机磷类、拟除虫菊酯类、有机氯类、三嗪类、氨基甲酸酯类等。某些有机磷农药的检测限可达到ng甚至pg级，一些试剂盒已经商品化，广泛用于现场样品和大量样品的快速监测。农药的酶联免疫试剂盒介绍：•目前用于现场快速筛选的有酶联免疫吸附测定法(ELISA试剂盒)和有机磷农药免疫胶体金快速检测试剂板。生物传感器法原理：对特定种类化学物质或生物活性物质具有选择性和可反应的分析装置。传感器中复杂样品中+识别反应如：酶与底物、如：光热、抗体与抗原、声音、（如：光敏管压电装置）外源凝集素与糖、颜色、光极光敏电阻、核酸与互补片段、电化学离子选择性电极•显示或记录特定的目标分析物物理化学信号生物敏感层转化器转换成第二信号(通常为电信号)放大生物传感器分类：•优点：测定方法多样化、提高测量灵敏度、缩短反应时间、提高仪器自动化程度和适应现场检测超临界萃取（SCFE）•生物传感器（根据信号转换器不同）分为：•光学传感器•电化学传感器•测热型传感器•半导体传感器电化学生物传感器•以电化学电极为信号转换器，和酶、微生物、动植物组织等其他生物识别元件结合组成。传感器中复杂样品中+酶促反应•显示或记录特定的目标分析物电活性物质（化学信号）酶电极电极电信号放大光学生物传感器•主要由光纤和生物敏感膜组成。传感器中复杂样品中+分子识别•显示或记录待测组分生物量（生物学信号）敏感膜中生物活性成分换能反应光信号（荧光、磷光等）放大其他生物传感器超临界萃取（SCFE）•农药残留检测的还有电晶体、半导体生物传感器等。•压电石英晶体传感器利用石英晶体对质量变化的敏感性，结合生物识别系统(抗原抗体特异性结合)而形成一种自动化分析检测系统。•具有灵敏度高、特异性好、响应快、小型简便等特点，可对多种抗原或抗体进行实时快速、在线连续的定量测定及反应动力学研究，克服了ELISA、RIA、荧光免疫分析法(FIA)等免疫检测方法费时、昂贵、标记及操作繁琐的缺点，具有极广泛的发展前景•石英晶体微量天平(QCM)半导体生物传感器，检测到低于1mg/L的西维因和敌敌畏。实验室快速检测方法色谱法荧光光谱法气相色谱法（GC)紫外-可见分光光度法红外光谱法毛细管电泳（CE）光谱法实验室快速检测高效液相色谱法（HPLC)薄层色谱法（TLC）色谱-质谱联用法农药快速检测技术的现状：超临界萃取（SCFE）•各种不同仪器技术的应用，大大提高了农药残留检测能力和检测的灵敏度、检测限和检测覆盖范围•采用现场快速初筛检测和实验室验证性检测结合，对结果阳性的样品用准确、可靠的方法进行验证，可大大减少分析工作量，提高分析效率，有利于加强农药残留监控的力度。农药快速检测技术现状：•快速检测方法在应用过程中仍存在不少问题：•如：1、酶抑制法容易出现假阳性、假阴性，•2、植物内含物对酶反应干扰严重，•3、不同批次酶的质量、反应温度、处理时间等对检测结果影响较大，导致检测的专一性、可比性等下降；•4、酶联免疫法在分析过程中出现交叉反应，导致检测的可靠性和灵敏度降低，方法难以标准化；•5、生物传感测定存在选择性不高超临界萃取（SCFE）、酶抑制法•1、速测卡法•可单独使用也可与便携式农药残留速测仪配套使用。•原理：利用速测卡中的胆碱酯酶(白色药片)可催化靛酚乙酸酯（红色药片）水解为乙酸和靛酚(蓝色），由于有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的活性有强烈的抑制作用，因此，根据显色的不同，即可判断样品中含有机磷或氨基甲酸酯类农药的残留情况。•样品处理分为整体测定法（浸提法）和表面测定法（粗筛法）超临界萃取（SCFE）模块3-1有机磷、氨基甲酸酯类农药快检便携式农药残留速测仪•目的要求对照仪器操作说明书，能够熟练操作，并能举一反三应用类似的快速检测仪。•检测原理便携式农药残留速测仪是根据国家标准方法GB/T5009.199-2003速测卡法（纸片法）而专门设计的仪器。农药速测仪是利用速测卡中的胆碱酯酶（白色药片）催化靛酚乙酸酯（红色药片）水解为乙酸和靛酚（蓝色），由于有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的活性有强烈的抑制作用，因此，根据显色的不同，即可判断样品中含有机磷或氨基甲酸酯类农药的残留情况。•器材：便携式农药残留速测仪、配套农药残留速测卡操作步骤（P22-23)•1、开机2、装片3、取样4、测试结果判定•与空白对照卡比较★阳性结果：白色药片不变色或略有浅蓝色不变蓝为强阳性结果→农药残留量较高浅蓝色为弱阳性结果→农药残留量相对较低★阴性结果：白色药片变为天蓝色或与空白对照卡相同、酶抑制法•2、分光光度法•原理：在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，抑制率与农药的浓度呈正比。本法利用酶催化乙酰胆碱水解，水解产物与显色剂反应生生黄色物质，该物质在412nm处有吸收，测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，通过抑制率可以判断蔬菜中含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留量的情况。超临界萃取（SCFE）模块3-1有机磷、氨基甲酸酯类农药快检、分光光度法•仪器：农药残留快速检测仪，电子天平，移液枪及配套管嘴，超声波提取仪，冰箱，恒温