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沃特世食品安全应用技术文集兽药残留检测完整解决方案目录UPLC/MS/MS快速分离鉴定13种磺胺4牛毛中超痕量水平类固醇酯的鉴定7复杂基质中的方法开发工具XevoTQD的RADAR功能分析鸡肉中的氯霉素12XevoTQ-S的“PICs”功能在同时准确定量和定性分析猪肝中痕量氯霉素中的应用 13使用ACQUITYUPLC和XevoTQ-S分析食品中致过敏物质肽16LC-MS/MS对食用肌肉组织中兽药多残留检测的提取和净化方案18XevoTQMS:应对生物样品生长促进剂领域的新挑战23应对富有挑战性的法规：生长促进剂地塞米松和倍他米松在肝脏和牛奶中的定量分析29OasisHLB净化和ACQUITYUPLC/TQD快速分析动物性食品中糖皮质类激素兴奋剂的含量33牛体内重组牛生长激素(rbST)快速高灵敏度检测 36ACQUITYUPLC/XevoTQ-S同时测定猪尿液中的21种β-受体激动剂 39使用配备ScanWave的XevoTQMS改善MS/MS灵敏性 42使用带RADAR功能的XevoTQMS同时采集常规MRMs和全扫描背景数据44[应用报告]4食品安全应用技术文集UPLC/MS/MS快速分离鉴定13种磺胺MarkE.BenvenutiandAislingO’Connor沃特世公司，美国马萨诸塞州米尔福德摘要本文介绍了用超高效液相色谱于3.5分钟快速分离13种磺胺，并用串联大气压电喷雾质谱快速鉴定其结构。前言磺胺类药物是近30年来迅速发展起来的一类抗菌药。近年来磺胺类药物发展很快，已有近20个品种投入市场，其中有近10个用于畜禽和水产养殖，例如磺胺二甲异嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶已大量用作兽药。调查表明，磺胺类药物在畜禽水产中用量很大，是肉食产品中最可能残留的药物之一，由于食用抗菌素污染的食品可引起人群的过敏变态反应，具有潜在致畸致癌和致突变的威胁，污染的食物链形成动物体和人体耐药菌的产生、传递和蔓延已引起了国内外的高度重视。欧盟在1999年制定的法规CouncilRegualation2377/90已将磺胺类药物列入可以使用，但规定了在肌肉、肾脏检出的最大残留限量（MRLs)，沃特世实验室采用超高效液相色谱质谱联用UPLC®/QuattromicroTM系统，建立了快速分析鉴定13种磺胺的药物分析方法。实验方法样品氨苯磺胺、磺胺二甲异嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺氯哒嗪、磺胺甲基异唑唑、磺胺二甲基异唑唑、磺胺间二甲氧嘧啶（上海药检所提供）。实验条件仪器：WatersACQUITYUPLC/QuattromicroMS/MSSystem超高效液相色谱条件：流动相：A:水:乙酸=81:1(V/V),B：乙腈流速：0.5ml/min二极管阵列检测器PDA：检测波长268nm柱温：25˚C色谱柱：ACQUITYBEHSHIELDC182.1mmx50mmx1.7mm时间-流动相组成梯度表：时间（min）A(%)B(%)曲线0.095511.090.59.562.2772394.0554564.2257514.2195516.09551质谱条件：大气压电喷雾电离源,正离子方式（ESI+)13对MRM多反应监测毛细管电压：3kv二级锥孔：5V光电倍增器：650V碰撞气压力：3.5x10-3mbar碰撞气流量：500L/hr锥孔气流量：50L/hr源温：105˚C名称保留时间Cone(V)Parent(M+H+)DaughterCollision（eV）氨苯磺胺sulfanilamide0.53017315620磺胺二甲异嘧啶isosulfamethazine0.83027918617磺胺嘧啶sulfadiazine1.03025115616磺胺吡啶sulfapyridine1.2302509216磺胺噻唑sulfathiazole1.32825615615磺胺甲嘧啶sulfamerazine1.43226515618磺胺二甲嘧啶sulfamethazine1.930279186175食品安全应用技术文集结果与讨论质谱碎片离子解析磺胺化合物在本实验中被观测到容易产生92/156的碎片离子(表2)。经核实其化学结构式（图1），例如，磺胺二甲嘧啶可在C-S处断裂产生92/186碎片，也可在S-N处断裂产生156碎片。其余磺胺类化合物也遵从以上规律，容易出现质荷比为92/156的碎片。HPLC/PDA分析结果(上海药检所提供)UPLC/PDA结果(五次进样实验谱图叠加)9种磺胺混合物经传统高效液相分离，所需时间为40分钟(图2)。利用超高效液相色谱UPLC分离13种磺胺，所需时间为3.5分钟（图4）。本实验采用UPLC-PDA二极管阵列检测器，通过查看UV特征吸收峰和PDA结果，能够方便推测确认化合物结构（图3）。UPLC/MS/MS结果(见下页图6)13种磺胺的MS/MS多反应监测MRM如图6所示，每张图为一种选择离子。表2.质谱参数表。接上页表格：图1.磺胺二甲嘧啶结构式。图2.九种磺胺液相色谱分离图。图3.磺胺间二甲氧嘧啶200-500nm的扫描图。图4.13种磺胺五次进样PDA结果重叠色谱图。图5.13种磺胺五次进样PDA结果。名称保留时间Cone(V)Parent(M+H+)DaughterCollision（eV）磺胺甲氧嘧啶sulfamonomethoxine2.23228115618磺胺甲噻二唑sulfamethizole2.3262719214磺胺氯哒嗪sulfachloropyridazine2.62828515615磺胺甲基异唑sulfamethoxazole2.73025415620磺胺二甲基异唑sulfafurazole2.8302689220磺胺间二甲氧嘧啶sulfadimethoxine3.14031115620[应用报告]6食品安全应用技术文集图6.十三种磺胺MRM图。总结相比传统高效液相色谱，超高效液相色谱UPLC分离时间大大缩短。利用WatersQuattro串联大气压电喷雾质谱MS/MS可快速鉴定化合物结构，提高样品检测的选择性，降低背景噪音，提高灵敏度。MS/MS多反应监测功能方便获得欧盟法规CouncilRegualation2377/90对最大残留限量药物的3分鉴定要求。[应用报告]7食品安全应用技术文集牛毛中超痕量水平类固醇酯的鉴定EmmanuelleBichon、LaurianeRambaud1、StéphanieChristien1、AurélienBéasse1、StéphaniePrevost1、FabriceMonteau1、BrunoLeBizec1和PeterHancock21LABoratoired’ÉtudedesRésidusetContaminantsdanslesAliments(LABERCA),ÉcoleNationaleVétérinaire,Agroalimentaire,etdel’AlimentationNantesAtlantique(ONIRIS),Nantes,France;2沃特世公司，英国曼彻斯特应用优势n准确测定牛毛中ng/g级别的类固醇酯。n该方法比现有的GC-MS/MS方法快5倍，单次测试就可分析所有酯类。n为任何不确定的尿液分析提供有效的和补充确认方法。n具有更高灵敏度，可减少基质干扰，改善牛毛发中所有违禁药物的检测。n可进行用药长时间后的化合物的检测和鉴定。沃特世解决方案ACQUITYUPLC®,Xevo®TQMS,XevoTQ-S,ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱,ACQUITYUPLC苯基色谱柱关键词类固醇酯、兽药、食品安全、牛毛、前体离子扫描目的该研究的目的是解决以前分析牛毛中类固醇酯（勃地酮、诺龙、雌二醇和睾丸素）时出现的大量分析难题。引言我们的食品供应安全不再被认为是理所当然的事情。随着世界形势变化和全球人口的持续增加，各组织机构满足安全食品供应的要求也不再是理所当然的。人接触兽类物质的一条途径是通过滥用或非法行为充斥的食物链，类固醇酯是引起关注的一类物质，其可能仍被用作生长促进剂，但现在被欧盟禁止用于饲养动物。1动物产品中不能含有这些合成代谢物质残留物。2如组织或尿液样本等许多生物基质都可用于控制类固醇酯，但由于易于搜集和在某些物质用药长时间后仍能检测残留物的原因，牛毛被认为是最灵敏的基质之一3-6。在尿液中很难区分曾经出现的内源性天然类固醇代谢物和来自酯水解的天然类固醇的相同代谢物7，另外天然类固醇通常被用作可在体内被迅速水解为天然类固醇的合成类固醇酯。用牛毛识别合成酯可为克服任何不确定的尿液分析提供一种有益、高效和补充确认方法，另外能够在用药长时间后检测和鉴定化合物是提供可信分析报告的强有力论据，该方法的主要问题是类固醇酯的浓度非常低（低ppb范围），另外样本数量有限（样本搜集实际原因，例如100毫克牛毛）。实验标准品所有类固醇酯参比化合物都由Steraloids有限公司（英国伦敦）提供。样本制备其他文献已经对毛发中类固醇酯的样本萃取和净化程序进行过介绍5,9。UPLC条件系统：ACQUITYUPLC运行时间：12.00min色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱，2.1x100mmx1.7μm柱温：50°C流动相：A:0.1%甲酸B:乙腈+0.1%甲酸流速：0.6mL/min进样量：3µL时间（min）流速（mL/min）%A%B初值0.6030.070.02.000.6030.070.08.000.600.0100.09.000.600.0100.09.010.6030.070.0[应用报告]8食品安全应用技术文集质谱条件系统：XevoTQMS极性：ESI+毛细管电压：3.50kV源温度：150°C脱溶剂气温度：450°C脱溶剂气体流速：1000L/hr碰撞气体流速：0.15mL/min附录1列有使用的MRM离子对以及前体离子实验条件。如文献记录所示，GC-MS/MS5或LC-MS/MS7-9都能检测相关含量的类固醇酯。如苯甲酸或癸类固醇等不容易挥发的化合物在常规GC/MS/MS分析时不会产生期望的结果，因为其要求仪器必须非常干净和仪器优化配置才能达到验证效果5，另外分析试验需要40分钟5，基于这些原因和期望一种确认用补充分析技术，我们用LC-MS/MS对牛毛中的类固醇酯进行研究分析。结果与讨论Nielen等人7和Duffy等人9在LC-MS/MS方面的工作有助于我们开展UPLC-MS/MS分析。UPLC优化根据Nielen等人7介绍的梯度在80%乙腈的初始条件下进行第一次试验，但不幸运的是，如含有短链烷基的雌二醇酯（醋酸酯、丙酸酯）等最常见极性化合物的洗脱位置太靠近死体积了。解决方案是降低初始乙腈百分比至70%，在前两分钟内保持在等梯度模式下，从而将它们有效分离。基于这些考虑，测试了2款1.7μm颗粒的不同化学特性沃特世色谱柱：十八烷基（ACQUITYUPLCBEHC18）和苯基（ACQUITYUPLCBEH苯基）。根据π-π机理预测雌激素在BEH苯基色谱柱中的比保留特性，在Waters®ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱上实现了最优分离，即使对雌激素酯也同样如此，如图1所示。但如果样本通量是需要解决的主要问题的话，则可使用苯基色谱柱在2分钟内将每种化合物分析完。对于牛毛样本，选择分离效果最佳的ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱将可能的基质影响降至最低。MS/MS优化经过对理论上专用于雌激素酯的负离子模式进行简短研究后，采用了正离子模式。所有考虑到的类固醇在这些条件下都总是检测到假分子离子。调节好毛细管和锥孔电压后在扫描模式下进行采集，得到最大强度的[M+H]+假分子离子。对每种假分子离子进行子离子扫描，发现碰撞室中与使用的特定碰撞能相关的主要碎片离子。经过手动调节碰撞能量后，每种化合物选择两种能量，可记录产生碎片离子的特定前体物质。勃地酮苯甲酸的样本全扫描和子