循环肿瘤标志物(CTC)检测技术在肺部小结节诊断中的最新进展1

循环肿瘤标志物（CTC）检测技术在肺部小结节诊断中的最新进展格诺生物刘双LungCancerinSolidTumorinChinaLDCT筛查降低肺癌死亡率NLSTresearchteam.NEJM,2011胸部CT筛查与过度诊疗的悖论大部分非实性成分的结节为良性疾病26.2%自行消失仅3%确诊为肺癌将所有肺部结节计算在内，假阳性率为21.8%-26.6%左右PinskyFR,etal.AnnInternMed,2015比较了两个大型临床研究的假阳性率NEJM发表的NLST研究中假阳性率第一次筛查为26.6%，第二次筛查为21.8%如何解决？第1-3次胸部CT筛查相比，第4次行胸部CT时I期肺癌的比例下降20%如何解决？PET-CT对于肺部良性结节，假阳性率约45%VeronesiG,etal.AnnIntMed2012如何解决？•创伤性检查–不良反应大–部分患者无法耐受肺癌病理活检局限性•成本高•术后并发症—对于部分年老或合并基础疾病的患者如何解决:能否有更敏感的肿瘤标志物来帮助诊断液态活检在肺癌中的应用治疗策略事件肺癌待查辅助诊断早癌肺癌晚期肺癌癌症耐药复发监测治疗方案选择疗效评估耐药机理新药研发治疗策略事件疑似肺癌辅助诊断早癌肺癌晚期肺癌癌症耐药复发监测治疗方案选择耐药机理新药研发CTC的临床应用价值疗效评估CTC(数量）(负向富集+靶向PCR）ctDNA(基因变异）1、K.Pantel,etal.NatRevClinOncol,2009;2、K.PantelandMR.Speicher,Oncogene2015什么是循环肿瘤细胞（CirculatingTumorCell，CTC）？肿瘤释放如外周血中CTCs数量的多少，可间接反应肿瘤发生发展的功能状态CTC：在肿瘤发生过程中，具有干细胞特征的肿瘤细胞和不具有干细胞特征的肿瘤细胞，均由原发肿瘤脱落释放入外周血，两者统称循环肿瘤细胞（CirculatingTumorCell）CTC1CTC≠有转移：侵入第二器官CTCs，称之为DTC（disseminatedTumorCell），只有由具有干细胞特征的DTC所形成的微转移灶，逃避免疫识别才可能发展成为肿瘤远处转移2CK+cellsHER-2+cells第9周的乳腺管组织切片：乳腺管周围非典型性增生第30周的肿瘤组织切片：新生的肿瘤上皮细胞形成牙槽并侵袭周围基质什么时候可以检测到CTC？早期肿瘤外周血中即可检出CTCWHe,etal.ProcNatlAcadSci,2007早期肿瘤外周血中即可检出CTC表达中等量FR的M109鼠肺癌细胞通过皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部侧面移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分钟可以检测到大约1.4个CTC细胞移植后第3和第4周，则每分钟可分别检测7个和18个CTC，随着肿瘤逐渐增大数量呈指数上升在肿瘤移植的前4周内，没有在任何组织切片中发现到存在转移性癌症的迹象CTC富集技术密度与大小免疫磁珠（负向富集or阳性富集)微流体CTC检测方法CTC检测技术靶向PCR免疫荧光普通PCR=+“方法”“收获”“垃圾”蟹饵没水了，我们躲不了了放水负向富集优势：回收率100%劣势：纯度略低正向富集优势：纯度高劣势：回收率低（漏掉CTC）幸好没贪嘴，我们逃了“方法”“收获”“垃圾”没水了，我们躲不了了放水负向富集优势：回收率100%劣势：纯度略低大小富集（ISET）优势：简单劣势：漏掉小的CTC细胞幸好没吃胖，我们逃了网筛CytoploRare®FR靶向PCRCTC检测技术负向富集靶向PCRFR阳性靶标肺癌细胞FR(叶酸受体）高度表达CTC：FR=1:50万EMT转化不影响FR丰度其他血细胞不表达FRCTC回收率接近100%磁珠富集易操作和自动化灵敏度超高，负向富集即可检测信号二次放大，1:1012倍放大无需人工经验判读，结果客观准确可实现CTC的定量CytoploRare®FR靶向PCRCTC检测格诺CytoploRare®灵敏度最高的检测技术特异性DNAPCR扩增-提高敏感性FR靶向：高特异性探针1CTCin6,000,000（可在600万个背景细胞中检测出一个CTC）CytoploRare®敏感性特异性可重复性临床应用便捷性CytoploRare®敏感性特异性可重复性临床应用便捷性CytoploRare®FR靶向PCRCTC检测靶向PCR，信号放大，保证高度敏感性1个CTC信号放大1012倍CytoploRare®FR靶向PCRCTC检测敏感性试验：1ctcin1,200,000白细胞JiataoLou,etal.PlosOne2013将不同数量的FR阳性肿瘤细胞分别掺入3ml全血(1.2-3.0X107）FR靶向PCRCTC检测技术的回收率接近100%，且呈线性分布检测灵敏度约为5.09/（1.2~3*107）=1/240万~600万掺入细胞数量(个)复管1复管2复管3检测均值检出细胞数(个)回收率(%)平均回收率(%)R600571.52565.13586.37574.34584.1297.3598.750.9998200198.93192.81185.90192.55192.4696.235056.5652.0750.8053.1449.4498.8959.909.2610.589.915.09101.8705.005.444.404.950.00/将不同数量的FR阳性肿瘤细胞分别掺入3ml全血(1.2-3.0X107）检测灵敏度约为5.09/（1.2~3*107）=1/240万~600万CytoploRare®FR靶向PCRCTC检测敏感性试验：1ctcin6,000,000白细胞CytoploRare®敏感性特异性可重复性临床应用便捷性CytoploRare®FR靶向PCRCTC检测技术FR（叶酸受体，高度特异性的靶向探针）特异性高：加入FR靶向探针前，加入高浓度叶酸封闭细胞表面的叶酸受体，检测结果为阴性背景表达：去除FR靶向探针，仅保留特异性DNA片段，与保留FR靶向探针相比，检测结果一致，提示背景可能为特异性DNA片段所致的固定值JiataoLou,etal.PlosOne20132004CellSearch:乳腺癌中检测出，但肺癌敏感性低2011CellResearch:采用的抗体(EpCAM)对EMT细胞特异性差，而肺癌细胞转移入血需要EMT的过程EpCAM阴性细胞中，存在大量CTCCellResearch系统主要使用EpCAM（上皮粘附分子）做为探针研究证实，EpCAM阴性的细胞中也存在CTCJiataoLou,etal.PlosOne2013有报道，部分激活的巨噬细胞存在FR的高表达1临床前研究证实，这部分巨噬细胞很少在正常人的外周血中出现2使用抗CD14免疫磁珠去除巨噬细胞后，CTC的检测结果无明显改变31、HeW,etal.IntJCancer2008;2、HeW,etal.ProcNatlAcadSci,2007;3、JiataoLou,etal.PlosOne2013CytoploRare®FR靶向PCRCTC检测技术巨噬细胞（可能存在FR表达）不影响检测结果CytoploRare®敏感性特异性可重复性临床应用便捷性CytoploRare®FR靶向PCRCTC检测技术同一患者重复检测，可重复性高CytoploRare®敏感性特异性可重复性临床应用便捷性3mL血→6个小时→得到报告检测流程肺癌领域，CTC检测技术对比CytoploRare®（格诺）CellSearch®CyttelTM（北京莱尔）CanpatrolTM（益善）CTC-BiopsyⓇ（武汉友之友)核心技术免疫磁珠负向富集靶向配体PCR技术流式正向富集技术荧光标记免疫磁珠负向富集、Fish技术ISET（滤膜）原位杂交RNA分析ISET（滤膜)荧光标记特异性88%80%83%75%70%灵敏度80%30%腺癌：46%30%30%自动化半自动全自动半自动半自动全自动血样体积3mL7.5mL4mL5mL10mL适应症早、中和晚期肺癌晚期乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌晚期肺癌、胰腺癌、乳腺癌晚期癌肿晚期癌肿早期（I期）敏感性68%0%20%(2/10)未报道未报道中晚期敏感性89%25%（22/87)61%-88%30%40%报告时间6h/12样本6h/8样本48h/1样本48h/1样本3天可视化否是是是是1210例受试者肺癌560例肺部良性疾病350例其他肿瘤(150例)肝癌30例结直肠癌30例乳腺癌30例胃癌30例食管癌30例331例A100例B50例C（21例D)79例DA:基线CTC检测B：术前术后CTC监测C：一线含铂双药化疗中CTC监测D：基线CTC、CEA、CYFRA21-1、SCC、NSE检测300例A50例D健康人150例100例A50例D150例A非动态研究肺癌560例A肺部良性疾病350例A健康人150例A动态监测研究非小细胞肺癌100例B50例C对比研究肺癌100例D肺部良性疾病50例D健康人50例D肿瘤特异性研究其他肿瘤150例AFR靶向PCRCTC检测技术临床试验设计（1210例,全国肺癌CTC研究最大样本量）JiataoLou,etal.PlosOne2013;YueYu,etal.TranslOncol2012;XiaoxiaChen,etal.JTO2015参加单位：上海市肺科医院上海市胸科医院医科院肿瘤医院特征例数(%)肺癌（n=560）年龄（平均值，范围）59.3岁(21-79岁)性别（男性/女性）349/211TNM分期Ⅰ期150(26.8%)Ⅱ期48(8.6%)Ⅲ期157(28.0%)Ⅳ期205(36.6%)病理亚型非小细胞肺癌465(83.0%)肺腺癌320(68.8%)肺鳞癌107(23.0%)大细胞肺癌5(1.1%)肺腺鳞癌1(0.2%)其他非小细胞肺癌32(6.9%)小细胞肺癌81(14.5%)其他肺癌14(2.5%)肺部良性疾病（n=350）年龄（平均值，范围）50.1岁(18-80岁)性别（男性/女性）310/140健康人（n=150）年龄（平均值，范围）34.7岁(22-60岁)性别（男性/女性）69/8142患者特征JiataoLou,etal.PlosOne2013;YueYu,etal.TranslOncol2012;XiaoxiaChen,etal.JTO2015FR靶向PCRCTC检测技术叶酸受体阳性CTC作为肺癌诊断的标志物43最大样本量CTC检测数据Cutoff：8.70CTCUnits/3mL敏感性：79.6%特异性：88.2%JiataoLou,etal.PlosOne2013;YueYu,etal.TranslOncol2013;XiaoxiaChen,etal.JTO2015AUC:0.8797FR靶向PCRCTC检测技术敏感性高——I期肺癌敏感性67.2%NSCLC患者与对照组的CTC、NSE、CEA、CA125、Cyfra21-1、SCC-AgROC曲线分析不同标志物在NSCLC和I期NSCLC患者中的灵敏度不同标志物在对照组的特异度检测方法cutoff值特异度（%）约登指数I期NSCLC灵敏度（%）AUC（95%CI）CTC8.64/ml84.10.57367.20.823(0.773-0.874)NSE18ng/ml95.90.0554.60.585(0.495-0.675)CEA5ng/ml94.90.2518.50.76(0.69-0.83)CA12535U/ml97.60.1754.60.505(0.417-0.592)Cyfra21-13.3ng/ml900.35232.30.716(0.615-0.816)SCC-Ag1.5ng/ml93.80.1512.30.624(0.535-0.713)FR-CTC、NSE、CEA、CA125、Cyfra21-1、SCC-Ag对NSCLC和早期