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2010年版《中国药典》生物检定部分修订内容高华中国药品生物制品检定所主要内容一、药品生物检定概况二、药品生物检定增修订情况药品生物检定概况定义应用范围作用药品生物检定--定义生物检定法是利用生物体包括整体、离体组织、器官、细胞和微生物等评估药物生物活性的一种方法。它以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计在一定条件下比较供试品和相当的标准品或对照品所产生的特定反应，通过等反应剂量间比例的运算或限值剂量引起的生物反应程度，从而测定供试品的效价、生物活性或杂质引起的毒性。药品生物检定体内测定（invivo）--以整体动物生物体体外测定（inbitro）--以离体器官、组织、微生物、酶和细胞（原代细胞、传代细胞）为生物体，利用这些生物体评价药品的生物活性（药效、活力或毒力）应用范围药品（生化药品、中药）生物制品（疫苗、血液制品）安全性检查应用范围对从动物脏器、微生物或体液等提取的，有效成分不够确切，多组分、结构复杂，理化方法不能有效鉴定并具有生物活性的天然生化药物、中药，以及有些生物技术药物，由于空间结构的细微变化，影响药物的活性中心位点，目前质量标准中仍应用生物检定法评估药物的生物活性。如生化药物：一般是从生物体分离、纯化所得如肝素钠、鱼精蛋白、促肾上腺皮质激素。中药：洋地黄制剂、人工麝香、水蛭等。药品生物检定—作用工艺与方法验证效价与活性鉴别作用—工艺及方法验证对于新生产工艺、新检测方法的改进、变更，往往需要生物检定来验证核对。中、外药典在重组人生长激素（rhGH）重组人胰高血糖素质量标准中明确规定，在生产研发阶段，“生产过程中的产品必须用体内生物检定方法测定其生物效价”，直到生产稳定为止。作用—效价与活性当采用理化方法测定如HPLC替代胰岛素等原有的生物效价测定法时，仍需作大量的方法比对、相关性研究等工作。作用—效价与活性定量的测定方法半定量的测定方法定量的测定方法效价（potency）测定是生物检定的主要内容，它是以药理为基础，生物统计为工具，运用特定的实验设计，利用生物体在一定条件下比较供试品与相当于标准品或对照品所产生的特定反应（可测量、量化的生理指标或生物药效或毒力）的一种定量的方法，因而被称为定量药理学。定量的测定方法胰岛素缩宫素肝素卵泡刺激素黄体生成素升压素硫酸鱼精蛋白洋地黄生长激素降钙素半定量的测定方法（活性检查）当理化测定占主导地位，效价测定一般来讲可以不必精确，可归于活性检查项，采用半定量方法，设定限值，不需精密生物统计，尽可能减少实验动物用量或其他生物体用量；甚至只用于定性的鉴别。例如：新药重组人胰高血糖素类多肽是治疗糖尿病用药，其质量标准中即采用该法（限值为小鼠血糖降低大于20%）进行活性检查。鉴别随着对动物保护意识提高，对实验动物减少、替代、优化（3R：Reduction、Replacement、Refinement）的实施，对能用理化测定的药品，生物效价测定逐渐降为鉴别项的定性或半定量测定。如USP升压素大鼠血压升高法用于鉴别。2010年中国药典缩宫素注射液将子宫收缩法放入鉴别项。二、附录生物检定方法增修订情况附录生物检定方法增修订情况附录增修订主要特点增修订主要内容附录检查法或指导原则药典增修订情况一部二部热原检查法修订修订细菌内毒素检查法修订修订异常毒性检查法新增修订溶血与凝聚检查法新增过敏反应检查法新增修订降压物质检查法新增修订生物检定统计法修订中药注射剂安全性检查法应用指导原则修订化学药品注射剂安全性检查法应用指导原则新增中药生物活性测定指导原则新增附录生物检定方法增修订情况附录增修订主要特点中药质量控制评价模式转变充分验证完善提高充分体现了“3R”原则附录增修订主要特点中药质量控制评价模式转变生物活性引入实现了中药质量标准由单一指标成分定性定量向活性有效成分及生物测定的综合检测。附录增修订主要特点充分验证：遵循科学性、合理性、可操作性，新建或新设立项目必须经不同实验室的共同验证或适用性研究，如注射剂安全性指导原则对方法学的适用性研究；中药生物活性指导原则要求对方法的专属性、准确性、精密度（重复性、中间精密度、重现性）、适用性、科学性进行了研究。附录增修订主要特点完善提高对2010药典一、二部检查法和指导原则进行修订和改进，对影响结果准确性的实验条件提出了要求，如热原检查法、溶血与凝聚、降压物质检查法、过敏试验。附录增修订主要特点体现了“3R”原则如热原检查法取消家兔使用次数和体重上限规定。中药生物活性指导原则中对动物的使用等。增修订主要内容一、热原检查法二、细菌内毒素检查法三、异常毒性检查法四、溶血与凝聚检查法五、过敏反应检查法六、降压物质检查法七、生物检定统计法八、中药注射剂安全性检查法应用指导原则九、化药注射剂安全性检查法应用指导原则十、中药生物活性测定指导原则热原检查法定义2010版与2005版区别修订背景实验用兔灵敏度测试热原检查适用性研究热原检查法定义：本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。2010版与2005版区别2010版2005版1、体重1.7kg以上（三部未改变）体重1.7~3.0kg2、其中升温达0.6℃的家兔应休息2周以上——3、____*每一家兔的使用次数，用于一般药品的检查，不应超过10次。*三部仍规定，对血液制品、抗毒素和其他同一过敏原的供试品在5天内可重复使用1次。2010版2005版4、在做热原检查前1-2日在作热原检查前1-2日5、温度相差不得大于3℃，且应控制在17～25℃（指实验室和饲养室）实验室和饲养室的温度相差不得大于5℃，实验室的温度应在17～25℃6、实验室温度变化不得大于3℃应注意实验室温度变化不得大于3℃2010版2005版7、应防止动物骚动防止动物骚动8、置于宽松适宜的装置中置于适宜的装置中9、且同组各兔间正常体温之差不得超过1℃且各兔间正常体温之差不得超过1℃2010版2005版10、与供试品接触的试验用器皿应无菌、无热原。去除热原通常采用干热灭菌法（250℃、加热30分钟），也可采用其他适宜的方法试验用器的注射器、针头及一切与供试品溶液接触的器皿，应置烘箱中用250℃加热30分钟，也可采用其他适宜的方法除去热原2010版2005版11、3只家兔体温升高总和低于1.3℃（三部未变，仍为1.4℃）3只家兔体温升高总和低于1.4℃修订背景１、热原实验是一个整体的动物实验，易受许多因素的影响。动物自身的行为、生理、外部环境以及一些实验过程等都可影响结果的准确性。２、对家兔体重取消了上限3.0kg，同时取消家兔使用次数不超过１０次的规定。修订背景３、增加了升温达0.6℃的家兔应休息2周以上新要求。4、实验环境要求更加严格：实验室与饲养室温度相差由不大于5℃改为3℃5、强调同组各家兔间温差不大于1℃，对家兔固定方式：宽松。6、判定标准更加严格：初试的3只家兔体温升高总和低于1.4℃改为低于1.3℃实验用兔灵敏度测试每年不定期随机抽取体重和使用次数不同的实验用兔，按热原检查法要求注射５EU/kg或10EU/kg内毒素标准品，应得到不符合规定的结果。热原检查适用性研究新品种建立热原检查标准时，建议进行适用性研究，在不影响家兔正常生理的前提下，按人用每公斤体重每小时最大供试品剂量的２－５倍设定限值。（化学药品一般为２－３倍，中药为３－５倍）。热原检查适用性研究适用性试验时设三组：⑴限值剂量的供试品组⑵10EU/kg内毒素组⑶含10EU/kg内毒素的供试品组。适用性试验判定：⑴组符合规定，⑵、⑶组不符合规定表明该品种可建立热原检查项。二、细菌内毒素检查法定义2010版与2005版区别修订背景注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查法指导原则二、细菌内毒素检查法定义：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。2010版与2005版区别2010版2005年版1、细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml2010版2005年版2、常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除常用的方法是在250℃干烤至少60分钟3、——或鲎试剂生产厂家推荐4、内毒素限值按L=K/M计算，M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62m2计算。注射时间若不足1小时，按1小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）内毒素限值按L=K/M计算，M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。修订背景1、细菌内毒素与检查用水除了强调内毒素含量外，还强调应对内毒素试验无干扰作用。2、强调用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除内毒素与热原法同步。3、根据某些药（如抗肿瘤药）用体表面积计算给药量的需要，增加了按体表面积给药时的计算方法。注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查法指导原则本原则依据2010年版药典制订，适用于注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查项目时进行的实验及研究。需建立内毒素检查项目的品种质量标准中有家兔热原检查法需转换为细菌内毒素检查方法的品种。用于注射给药，但未有热原质量控制的品种。注射用新药需建立热原质量控制的品种。用于静脉给药的原辅料建立方法时对鲎试剂及样品的要求同时使用两个鲎试剂厂家的鲎试剂每个品种至少三批样品（上市品种应检测两个以上生产厂家；新药需检测连续生产的样品）。确定内毒素限值一般按公式L=K/M计算。M为人每公斤每小时临床最大用药剂量，依据药品使用说明书，《临床用药须知》确定。儿童用药如大于成人，以儿童为准。为保障安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗心血管疾病等重症用的药品、需联合用药的药品，可根据计算值适当调整，严格至计算限值的1/2或1/3。对于体积在100ml以上（包括100ml）的复方静脉输液类品种，内毒素限值一般按0.5EU/ml计。其他单方静脉输液品种除另有规定外也可按用药剂量计算，以EU/mg或EU/U表示。对于美国、欧洲或日本药典已收载的，并已建立细菌内毒素检查法的品种可参考国外药典规定的限值，与按公式计算出的数值比较，以严格者为该品种的限值。如果使用的是国外药典的限值，应以最新版本药典为准。干扰实验建议使用较低灵敏度鲎试剂(0.5EU/ml或0.25EU/ml),以避免供试品中内毒素的阳性影响。三.异常毒性检查法定义2010版与2005版区别三.异常毒性检查法定义：本法系给予小鼠一定剂量的供试品溶液，在规定时间内观察小鼠出现的死亡情况，以判定供试品是否符合规定的一种方法。三.异常毒性检查法异常毒性有别于药物本身所具有的毒性特征，是指由生产过程中引入或其他原因所导致的毒性反应。供试品如不合格，表明药品中含有超过正常产品毒性的毒性杂质，临床用药将可能增加急性不良反应。2010版2005版1、本法系给予小鼠一定剂量的供试品溶液本法系将一定剂量的供试品溶液注入小鼠体内或口服给药2、制备配制四.溶血与凝聚检查法定义2010版与2005版区别修订背景四.溶血与凝聚检查法定义：本法系将一定量供试品与2%的家兔红细胞混悬液混合，温育一定时间后，观察其对红细胞状态是否产生影响的一种方法。2010版2005版1、2%的家兔红细胞混悬液2%的兔（或羊）红细胞混悬液2、取健康家兔血液取