第03章细胞生物学研究方法1

细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法分类1．形态学观察方面：显微成像技术2．生化分析方面：分离技术、细胞化学技术3．生理测定方面：细胞电泳技术、膜电位测定4．实验技术方面：细胞工程技术、单克隆技术本章内容细胞形态结构的观察方法细胞组分的分析方法细胞培养、细胞工程与显微操作技术用于细胞生物学研究的模式生物第一节细胞形态结构的观察方法•光学显微镜技术：以可见光（或紫外线）为光源。•电子显微镜技术：以电子束为光源。分辨率Resolution►分辨率是指区分开两个质点间的最小距离的能力。人眼分辨率：0.1~0.2mm光学显微镜：0.2m扫描电镜：3nm透射电镜：2nm扫描隧道电镜：0.1nm（一）普通复式光学显微镜技术1.构成：①照明系统②光学放大系统③机械装置2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。3.普通复式光学显微镜的分辨率n：折射率：物镜镜口角思考：如何提高显微镜的分辨能力？4.光镜样本制作整体观察：足够透明的活的或死亡的物体用透射光直接进行观察。切片观察：固定包埋切片染色观察（二）相差和微分干涉显微镜技术Differential1、特点把透过标本的可见光的光程差或相位差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。•在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。•1.环形光阑：位于光源与聚光器之间。•2.相位板：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。2.用途：观察未经染色的玻片标本微分干涉差显微镜Differentialinterferencecontrastmicroscope（DIC）•利用两组平面偏振光的干涉加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。明视野、相差、微分干涉反差显微镜观察到的细胞的比较（三）荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）1.原理荧光显微镜是以紫外光或蓝紫光作光源，激发标本产生荧光，从而用于细胞特殊成分和结构的观察。荧光染料或荧光基团吸收不可见的紫外光，释放出部分波长较长的可见光，该现象称为发荧光。荧光显微镜及其光路图2.荧光显微镜的结构特点•特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；有特殊的滤镜：激发滤镜、阻断滤镜、二向色镜；特殊的“UV”物镜。3.荧光显微镜的用途用途：•免疫荧光观察•特异性大分子物质蛋白质、DNA、RNA、抗原等的定性、定量、定位研究•疾病诊断4.荧光标记技术（1）荧光素直接标记技术：观察能激发出荧光的结构。（2）免疫荧光标记技术：将荧光染料与抗体结合，制备成荧光抗体，用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位的技术。如绿色荧光蛋白(GFP)的应用。如绿色荧光蛋白(GFP)的应用构建GFP的编码区与被研究的蛋白质的编码基因重组DNA转染细胞组成融合蛋白在荧光显微镜下跟踪定位揭示蛋白参与的动力学活动。（四）激光共聚焦扫描显微境Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM•用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。•分辨力是普通光学显微镜的3倍。•用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。LCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)（五）荧光漂白恢复技术•利用高能量激光速的照射，是特定区域的荧光发生不可逆的淬灭。•光漂白区荧光的恢复，由非漂白区荧光标记分子的运动来完成。•用于检测活体细胞内分子运动等。（六）当代光学显微镜的发展趋势•采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。•自动化与电子化。二、电子显微镜技术电子显微镜的诞生电子显微镜是在1931年，由德国科学家EnestRuska和MaxKnoll首先发明的。1986年，世界上第一台透射电镜的发明者E．Ruska与发明扫描隧道显微镜的科学家G．Binnng和H．Rohrer一起荣获诺贝尔物理奖。（一）电子显微镜的基本知识不同光线的波长名称可见光紫外光X射线α-射线电子束10Kv波长（nm）390~760130~3900.05~130.005~10.01221.电子显微镜与光学显微镜的基本区别分辨本领光源透镜真空成像原理人眼0.2mm可见光光学显微镜200nm可见光(波长400～700nm)利用样本对光的吸收形成明暗反差和颜色变化100nm紫外光（波长约200nm）玻璃透镜不要求真空电子显微镜接近0.1nm电子束(波长0.01～0.9nm)电磁透镜1.33×10-3～1.33×10-5Pa利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差2.电镜的分辨本领与有效放大倍数电镜的分辨本领是指电镜处于最佳状态下的分辨率。由于电磁透镜在成像过程中存在的各种像差、色差、衍射差，再加上生物样品本身等因素的影响，一般用透射电镜观察生物样品时，能分辨清楚的两个点之间的距离为0.5～1nm。其有效放大倍数可达100万倍，如果超过100万倍，所得的图像就模糊不清了，我们把这种多余的放大称为“空放大”。透射式电子显微镜1）电子照明系统以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。2）电磁透镜成像系统：物镜、中间镜、放大镜为中空圆柱体，由线圈调节电流大小，以次改变磁场强度。3）真空系统：真空泵，一般分机械泵和扩散泵两级4）记录系统：荧光屏、感光胶片3.电镜的基本构造电镜成像的原理在真空条件下，电子束经高压加速后形成极细的快速电子束流，即电子射线。当它与样品发生作用时，由于样品的厚度和质量有差异，能产生多种带有样品信息的讯号。这些带有样品信息的电子束流经物镜作用产生样品的最初放大像，接着经中间镜和投影镜两种电磁透镜再次放大之后，带有样品信息的电子最终激发荧光屏，形成能用肉眼观察的电子显微图像。电镜与光镜光路图比较（二）主要电镜制样技术表现样品的二维超微结构、应用广泛的超薄切片技术；显示表面超微结构、立体感较强的扫描电镜样品制备技术呈现生物膜的断裂面超微结构的冷冻蚀刻技术；用于细胞内化学成分的定性和定位研究的电镜细胞化学技术；进行细胞内抗原（抗体）的定性和定位研究的免疫电镜技术；探测细胞内大分子合成、运输动态过程的电镜放射自显影技术；研究病毒和生物大分子等悬浮材料的负染术.1.超薄切片技术•普通超薄切片术指不需要特殊的冷冻条件的常规包埋切片技术。它包括取材、固定，脱水、渗透、包埋、聚合、切片、染色等几大部分。其中每一部分都是重要的环节，与观察结果密切相关，所以为了得到可靠和满意的结果，需要步步谨慎认真。超薄切片技术1）取材和固定取材和固定要遵照“准”、“快”、“轻”、“优”的操作原则。固定液：2％～5％戊二醛1％四氧化锇（即锇酸）2）脱水原因：A.生物样品中水分的比例可达70％～80％以上，而水中又有85％～90％为游离态水，如包埋前不彻底除去游离态水，将造成切片困难和成像模糊等。B.单纯的烘干会使样品收缩，破坏其超微空间结构。脱水剂的配制和脱水方法最常用的是乙醇和丙酮。一般用乙醇脱水时，其浓度梯度为30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％，每步10～15分钟。另外，100％一步要重复一次，70％以前需在4℃条件下操作，从80％起可转至室温。3）包埋与聚合•包埋的目的是聚合成硬块的单体树脂，一方面要支撑样品本身的超微结构，另一方面使能切片。把具有这种特性的单体树脂称为包埋剂。•环氧树脂类包埋剂•4）超薄切片与染色•修块制刀切片载网支持膜电子染色•醋酸双氧铀对富含有羧基和磷酰基的结构有广泛而明显的染色效果，如：脱氧核糖核酸（DNA）、蛋白质和结缔组织等。•柠檬酸铅细胞核与核蛋白颗粒对铅离子的亲和力强。电镜的标本制备－超薄切片技术电镜下细胞超微结构2.负染技术用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。NegativeStainedActin3.冰冻蚀刻freeze-etching亦称冰冻断裂。标本干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。冰冻蚀刻技术样品冷冻断裂蚀刻喷镀复型深度蚀刻技术显示原生动物四膜虫纤毛轴丝的电镜照片。箭头指出一排特意动力蛋白外臂。4.电镜三维重构技术电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学的主要实验手段。ATP合成酶由X-射线晶体衍射(2.8A)所揭示的核小体三维结构（引自K.Luger等，1997）a.通过DNA超螺旋中心轴所显示的核小体核心颗粒8个组蛋白分子的位置；b．垂直与中心轴的角度所见到的核小体核心颗粒的盘状结构；c．半个核小体核心颗粒的示意模型，一圈DNA超螺旋（73bp）和4种核心组蛋白分子，每种组蛋白由3个α螺旋和一个伸展的N-端尾部组成。N-端尾部有序排列，参与核小体之间的相互作用，以形成螺线管等高级结构。5.扫描电子显微镜（Scanningelectronmicroscope，SEM）•20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。•分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。工作原理•是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。•为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。三.扫描隧道显微镜（scanningtunnelingmicroscope，STM）►分辨率0.1nm►大气介质、液体环境、直接观察分子►量子力学原理：IVbexp（-A1/2S）I真空隧道电流；Vb外加电压；exp指数；A常数；平均功函数；S导体间或探针与样品间的距离原理•根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。诺贝尔奖得主（从左到右）：电镜的发明者ErnstRuska,扫描隧道电镜的发明者GerdBinnig&HeinrichRohrer装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。特点：（1）分辨本领高，（侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.001nm）；（2）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；（3）非破坏性测量。用途：纳米生物学研究领域中的重要工具扫描隧道显微镜示意图STMimage,BenzenemoleculesaccumulateatstepedgesonCu电镜技术的未来1多技术、方法的相互协作2仪器装置的不断完善3计算机技术的不断渗入4电镜样品制备技术的不断创新