生物化学技术10 固定化的酶与微生物

第十章固定化的酶与微生物一、固定化的酶与固定化微生物的概念是一类由生物细胞产生的具有催化功能的生物大分子（蛋白质），通常称作生物催化剂酶:固定化酶(inmobilizedenzyme)是用适当的物理、化学方法把纯化的酶固定于一定的空间内，使其成为既保持了本身的特性，又能在连续反应之后可以回收和重复使用的一种制品是用适当的物理、化学方法把纯化的微生物固定于一定的空间内，使其成为既保持了本身的特性，又能在连续反应之后可以回收和重复使用的一种制品固定化微生物固定化酶和固定化微生物的研究历史:1916年Nelson和Griffin发现:有些酶虽然不溶于水，但是仍存在催化活性现象1953年Grubhofer和Schleith真正开始固定化酶的研究1960年之后，Katzir-Katchalski学派对酶的固定方法和固定化酶的理化性质做了大量的工作，并将其成功地应用于工业生产1969年千烟一郎也成功地将固定化氨基酰化酶应用于DL-氨基酸的光学拆分过程，使其反应实现了连续化1973年千烟一郎研制成了大肠杆菌(E．coli)的固定化细胞，即所谓固定化微生物，并将其用于连续生产L-天门冬氨酸过程。固定化微生物虽然仅较适用于催化小分子物质的转化，并伴随发生分解生成物等副反应，但它工序简单、稳定性好、酶活力丧失少、成本低廉，以及利用其固有的多酶系统可对有机体的代谢途径进行研究固定化微生物的特点:本章将就固定化的酶与微生物的制备方法及其制品的性质和应用进行讨论三、固定化酶的制备（一）酶固定化的前提条件酶的活性中心(催化部分)和空间结构(结合部分)的维持是其具有催化活力的必需条件。因此，在制备固定化酶时，要尽可能避免采用剧烈的条件（过高的温度和盐浓度、强酸和强碱，以及各种有机溶剂等）处理。不然，酶的催化作用会降低，甚至丧失，或者改变酶对底物的专一性（二）酶的固定化方法固定化酶制备方法，根据制备原理分类：制备固定化酶的模式图：1．载体结合法(1)物理吸附法载体类型：是将酶蛋白吸附到水不溶性的惰性载体(它是以共价或非共价键结合其他物质的一种基质)上制成固定化酶的过程。制备原理：常为疏松多孔的吸附材料；如：多孔玻璃、活性炭、酸性白土、羟基磷灰石、磷酸钙凝胶以及淀粉等物质。酶与载体的相互作用较弱，二者之间易于分离。缺点：酶活力不易丧失，蛋白质的空间结构不发生明显变化。优点：(2)离子结合法载体类型：将酶以离子结合的方式固定到具有离子交换基团的非水溶性载体上制成的固定化酶。制备原理：常为带各种离子基团的硅胶、纤维素、交联葡聚糖和树脂等物质。酶与载体的结合力不高，且易受缓冲液类型和pH值高低的影响。应用这种固定化酶反应时，溶液的pH值、离子强度、温度和底物浓度发生变化，往往可引起酶的脱落。。缺点：优点：操作较简便、条件较温和、酶活力不易丧失。(3)共价结合法是将酶的非必需基团(α-氨基，ε-氨基，α、β、γ-羧基，羟基，咪唑基等)通过共价键或整合剂偶联于固相载体上而制成固定化酶。制备原理：有硅胶、纤维素、琼脂糖和交联葡聚糖，以及聚丙烯酰胺凝胶等物质。酶与载体结合很牢固，使用周期长（该法目前应用较为普遍）。优点：载体类型:操作较复杂、条件较剧烈、酶活力丧失较多。缺点：根据偶联反应方式类型的不同，可将共价结合法分为：共价结合法重氮法多肽法烷化法缩合剂法载体交联法叠氮法卤化氰法载体共价交联法“酶网’’载体法●重氮法制备原理：常用载体:先将载体（带氨基的芳香族化合物R-Y-NH2）用稀盐酸和亚硝酸钠（相当于亚硝酸）处理生成重氮盐化合物，然后与酶蛋白的酚基、咪唑基发生偶联反应(游离氨基也能发生十分缓慢的反应)，制成固定化酶（形成偶氮化合物）有对氨苄基纤维素、聚氨基聚苯乙烯、3-对-氨苯氧基-2-羟丙酰纤维素、氨基酸共聚物、交联葡聚糖-氨茴香酸酯等proENNYRNYRHClNaNONHYR222弱酸性环境加入酶蛋白，低温（0~5℃）●多肽法利用肽的合成原理，使酶蛋白和载体之间以肽键连接而制成固定化酶的过程。它又分叠氮法和卤化氰法等◆叠氮法先用羧甲基纤维素甲酯与水合肼作用形成酰肼，然后再与亚硝酸反应得到叠氮化合物，再在低温条件下，该化合物和酶的游离-NH2、-OH和-SH反应形成肽键，即偶联成固定化酶◆卤化氰法此法与第七章“亲和层析”中亲和吸附剂的制备原理相似。先用卤化氰(常用的是溴化氰CNBr)活化纤维素、交联葡聚糖和琼脂糖等多糖类载体，然后在偏碱性环境条件下，使载体（基质）与酶（配体）进行偶联，即可制成固定化酶●烷基化法制备原理：常用载体:利用蛋白质N末端游离-NH2、Tyr的Ph–OH、Cys的–OH等与含卤族功能团的非水溶性载体发生烷基化反应（由酶蛋白取代卤族功能团）制成固定化酶氯乙酰纤维素、溴乙酰纤维素、碘乙酰纤维素、聚乙二醇碘乙酰纤维素和二氯-S-三嗪基纤维素等。其中二氯-S-三嗪基纤维素是带正电荷的，它对中性或碱性的酶蛋白、或作用于带负电荷底物的酶蛋白进行固定化较为有利，用其制备的固定化酶活力较高。●缩合剂法将酶（含-COOH和-NH2）与含-NH2和-COOH的载体（R-NH2或R-COOH）在缩合剂碳化二亚胺（R1-N=C=N-R2）或伍德沃德试剂K(N-乙基-5-苯异口恶唑-3′-磺酸)作用下进行缩合反应，制成固定化酶制备方法：●载体交联法这种制备固定化酶的方法有的地方把它归到交联法。因为它们都是通过一个中间工具“交联剂”（如戊二醛等）将酶固定化的。载体交联法是在酶与载体之间进行交联，使酶固定化；而交联法是在酶分子与酶分子之间进行交联，制成网状结构的固定化酶2、交联法交联法是酶分子之间在双功能基团交联剂作用下，相互交联呈网状结构的固定化酶过程。最常用的交联剂是戊二醛，它和酶蛋白中的游离氨基形成希夫氏(Schiff)碱，从而使酶分子之间相互交联成固定化酶。此外，顺丁烯二酸酐或乙烯共聚物与酶分子在六甲撑二氨作用下，相互间进行反应，亦可制成固定化酶3、包埋法定义：就是将酶包裹到高分子凝胶等物质的细微网格中，或包埋到高分子半透膜中制成固定化酶的方法分类：包埋法根据包埋分式不同分为网格型和微囊型由于包埋法制备固定化酶的过程中，酶本身不发生物理化学变化，故其活力回收率较高，适用于固定各种类型的酶。目前应用较多的是格子型包埋法，此法所用的材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、天然琼脂糖和淀粉等，用其制备固定化酶的操作简单这种固定化酶制品却只能应用于底物和产物的分子质量都小的反应中优点：缺点：四、固定化微生物的制备目前，固定化微生物的制备方法最多的是包埋法，其次是载体结合法和交联法；另外，还有用选择性热变法制备固定化微生物的，就是将细胞在适当温度下进行处理，使细胞膜蛋白变性，但不使酶变性而使酶固定与细胞内的方法采用包埋法制备的部分固定化微生物及其用途五、固定化酶和固定化微生物的性质（一）相对活性固定化酶(或微生物)的活力，通常用“相对活力”表示，即以固定化酶(或微生物)的活力与同样量游离酶活力之比称为相对活力；一般用百分数表示。以游离酶(或微生物)的活力为100作比较●概念：●酶固定化以后，活性降低的原因：（1）酶蛋白空间构象改变，空间位阻效应增加，而酶的催化活性与其特定的空间结构密切相关；尤其是共价结合法和交联法（酶的活性基团参与反应）对空间结构的影响更大（2）酶与载体偶联后产生的空间位阻效应降低了酶分子周围的底物浓度，减少了酶与底物接触的机会；使反应减慢，表现出酶活力下降（3）包埋法中凝胶通透性的影响，使酶与底物的接触受到限制另外，有些固定化酶(或微生物)相对活力的大小，还会受到底物与载体性质、酶的类型、酶量以及制备方法等因素的影响（二）活力曲线与最适pH值固定化酶(或微生物)的活力曲线与最适pH值的变化：酶(或微生物)固定化后，其活力曲线和最适pH值，一般会发生偏移活力曲线和最适pH值偏移的原因：①酶固定化后，部分氨基酸侧链和酶分子的净电荷发生了改变，随之酶活性基团的解离值(pK)也改变；而酶的活性与其解离状态相关；②由于载体的理化性质受到影响，致使固定化酶颗粒扩散层内外的[H+]浓度产生差异，其中多阴离子衍生物载体带负电荷，最适pH值向碱侧偏移，而多阳离子衍生物载体带正电荷，最适pH值则向酸侧偏移；③酶反应产物导致固定化酶颗粒内带电微环境的改变（在大多数情况下，固定化酶的活力曲线要比游离酶陡峭）②的解释：在固定化酶反应体系中，酶颗粒周围存在一个极薄的扩散层，带电的载体使固定化酶微环境中的带电状态不同与外环境。带负电荷的载体会使料液中H+局部集中于扩散层，使固定化酶微环境的PH值低于外侧料液的PH值；为了抵消这种影响，需提高料液的PH值，才能使固定化酶达到最大的催化速度；所以，带负电荷的载体通常使固定化酶的最适PH值向碱侧偏移，而带正电荷的载体则通常使固定化酶的最适PH值向酸侧偏移活力曲线和最适pH值偏移的表现综上情况可以看出，酶(或微生物)经固定化后，其活力曲线和最适pH的变化是有一定规律的。因此，当酶的最适pH与其所处的环境pH不相同时，可通过选择适当的载体进行固定，以改变其最适p值，使之与环境相一致，从而使固定化酶活力达到最大。特点：①固定化酶的稳定性一般都优于游离酶但是，也有的酶在固定化后，稳定性降低了。②固定化微生物的稳定性，基本上与固定化酶相近。固定化酶稳定性提高的原因可能是：带电荷载体与酶分子之间产生了静电作用，对酶的特定空间构象起到稳定作用蛋白水解酶在固定化后避免了酶自身的消化现象发生固定化以后，由于空间位阻，降低了变性剂、解离剂、有机溶剂等对酶的进攻破坏作用（三）稳定性（四）米氏常数●米氏常数（Km）是酶的一个特征性常数，每一种酶都有一定的Km值，其倒数1/Km称为亲和常数，用来表示酶与底物的亲和力；而固定化酶的Km值和最大反应速度（Vm）常因酶蛋白结构的变化和载体带电荷的影响而变化。此外，随着反应体系离子强度的增大，或者载体粒度的增大，米氏常数也会增大。一般，载体的颗粒越小，固定化酶越接近游离状态的酶，米氏常数就越接近。●固定化酶的最大反应速度与游离酶相比，要依具体情况而定。大多数酶经固定化以后，Vm变化不大，但也有由于固定化方法不同而有差异的。如：以多孔玻璃为载体共价结合的转化酶，其Vm与游离酶相同；但用PEAE凝胶包埋的转化酶，其Vm却只相当于游离酶的1/10。（五）其他1、PH值的影响：酶用带负电荷的载体固定时，在偏酸性环境条件下可增加固定化酶的稳定性；相反，酶用带负电荷的载体固定时，在偏碱性环境条件下可增加固定化酶的稳定性2、酶固定化以后，抗氧化能力增强3、固定化微生物，如含精氨酸脱亚胺酶的恶臭假单包菌，用PEAE凝胶包埋后，由于细胞膜结构发生改变，导致起对底物（S）和产物（P）的选择性丧失，从而提高了固定化微生物的相对活力六、应用固定化酶(或微生物)比游离酶(或自然微生物)不但稳定性好，而且与底物和产物更容易分开，所以在工业、医学、药学和生化分析等方面的应用发展较快（一）工业方面应用由于酶固定化以后，既稳定，又容易与S和P分离，并且可以重复使用；所以固定化酶在工业上的应用既经济又实用例1、L-氨基酸的生产是利用固定化氨基酰化酶反应进行的生产步骤：先将氨基酰化酶吸附于DEAE-交联葡聚糖A-25，制成固定化酶反应柱，在柱中通入DL-氨基酸的N-酰化衍生物，然后采用溶解度法把L-氨基酸和酰化-D-氨基酸分开（这样就得到了光学纯度好，回首率高的DL-氨基酸）例2、利用固定化多酶反应柱生产3-磷酸甘油醛多酶反应柱，从上到下依次分别为用聚丙烯酰胺凝胶包埋的己糖激酶、磷酸己糖异构酶、6-磷酸果糖激酶-1、醛缩酶（裂解酶）。当向反应柱注入一定比例的G、ATP、Mg2+混合时，这些底物原料流经反应柱时，依次被己糖激酶、磷酸己糖异构酶、6-磷酸果糖激酶-1和醛缩酶催化反应，生成3-磷酸甘油醛（二）医学方面固定化酶在医学方面的应用，目前正在积极的研究和开发。其中用包埋法制备的固定化酶，在治疗酶缺乏症和代谢异常症等疾病时，有很好的发展前景。例1在小白鼠腹腔内，分别注射生理盐水、游离的和固定化的天冬