生物化学第10章酶的作用机制和酶的调节

第10章酶的作用机制和酶的调节一、酶的活性部位二、酶催化反应的独特性质三、影响酶催化效率的有关因素四、酶催化反应机制的实例五、酶活性的调节控制六、同工酶(mechanismsofenzymeactionandregulationofenzymeactivity)一、酶的活性部位酶活性部位的特点Ⅰ在酶分子中，只有少数几个氨基酸残基直接参与结合底物和催化反应，这些氨基酸残基在一级结构上可以相距很远，但通过肽链的折叠、盘绕，使它们在空间上相互接近。这些残基在空间上所在的部位称为活性部位（activesite）或活性中心（activecenter），酶的活性部位往往有一个裂缝或口袋状的区域，其形状与底物相似。胰凝乳蛋白酶活性部位的结构57102195酶活性部位的特点Ⅱ当底物与酶通过次级键结合时，底物和酶都可能发生形变，诱导契合，使得底物与酶的活性部位的形状恰好吻合，而且负责催化反应的残基也正好接近将发生反应的基团或键。当酶蛋白变性时，构象发生变化，失去上述结构特点，同时也失去了活性。虽然酶蛋白中其它残基不直接参与活性部位的组成，但这些残基中的大多数为整个酶蛋白的构象作出了不可缺少的贡献。研究酶活性部位的方法1.酶分子侧链基团的化学修饰法（1）非特异性共价修饰（2）特异性共价修饰（3）亲和标记法2.动力学参数测定法3.X射线晶体结构分析法4.定点突变法酶分子侧链基团的化学修饰法用一种小分子化合物与酶反应，这种化合物与酶的某个或某种残基侧链反应，形成共价结合，这叫化学修饰（chemicalmodification）或共价修饰（covalentmodification），这种化合物称为修饰剂。酶分子中可以被化学修饰的基团有：巯基、羟基、咪唑基、氨基、羧基和胍基等。当酶活性部位的残基侧链被修饰后，会使酶失去活力。将经修饰后失去活力的酶水解，鉴定出被修饰的氨基酸，可以得到哪些残基参与组成活性部位的信息。非特异性共价修饰此类修饰剂可以修饰活性部位内或外的残基侧链基团。若修饰程度与酶活力丧失成正比，则说明被修饰的基团位于活性部位。当发现修饰程度与酶活力丧失成正比时，可在加入底物或竞争性抑制剂的条件下进行修饰，若加入底物或竞争性抑制剂可阻遏修饰剂对酶活力的破坏作用，则进一步证明被修饰的基团位于活性部位。特异性共价修饰此类修饰剂特异性地修饰酶活性部位的残基，同时使酶失活。此类修饰剂与酶的活性部位特异性结合，同时修饰酶活性部位的基团。例如二异丙基氟磷酸（DFP）能特异性地与许多酶的活性部位的Ser残基共价结合，使酶活力丧失，而不修饰非活性部位的Ser残基。当用DFP修饰酶后，部分水解酶蛋白，得到含有二异丙基磷酰基的肽段，分析此肽段的氨基酸序列，可得到活性部位Ser附近的肽链序列。DFP修饰酶的Ser残基的反应几种丝氨酸蛋白酶活性部位的氨基酸序列酶氨基酸序列牛胰蛋白酶……Ser-Cys-Gly-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Val……牛胰凝乳蛋白酶……Ser-Cys-Met-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu……猪弹性蛋白酶……Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu……猪凝血酶……Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro……亲和标记法能特异性地修饰酶的活性部位的修饰剂很少，并且专一性差，经常出现也修饰活性部位之外的残基的情况。为了解决此问题，人们合成了一些底物类似物，其上带有高反应性基团，它们特异地与相应的酶的活性部位结合，然后与活性部位的残基反应，这样就大大提高了修饰的专一性，这种方法叫亲和标记法。TPCK对胰凝乳蛋白酶的亲和标记最典型的例子就是用来修饰胰凝乳蛋白酶的亲和标记物对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK），胰凝乳蛋白酶的人工底物是对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸乙酯（TPE）。当将TPDK与胰凝乳蛋白酶一起保温后，酶失去活性，氨基酸分析表明，TPDK修饰了His57。TPCK不与胰凝乳蛋白酶原、变性的胰凝乳蛋白酶、DIP-胰凝乳蛋白酶反应。这些证据说明His57是组成酶活性部位的残基之一。TPE和TPCK的结构亲和标记物人工底物动力学参数测定法在不同pH下测定酶活力，可以得到与酶活力直接相关的可解离基团的pKa值，从而推测出是些什么残基。X射线晶体结构分析法使底物与酶结合，制成晶体，再进行X光晶体衍射分析，可得到底物附近有哪些残基。定点突变法从基因的水平上对蛋白质编码序列中特定位点的核苷酸进行突变，使得蛋白质特定的氨基酸残基转变成另一种氨基酸残基，观察突变对酶活力的影响。例如，1987年Claik将胰蛋白酶Asp102突变成Asn102，突变的胰蛋白酶的kcat只有野生型酶的五千分之一，突变酶水解酯底物的活力仅是野生型酶的万分之一，可见Asp102对胰蛋白酶的活力是必需的。三、影响酶催化效率的有关因素底物和酶的邻近效应与定向效应（proximityandorientation）对于双底物反应或三底物反应来说，由于酶活性部位对底物有高亲和力，增加了参与反应的底物碰撞的几率，这就是邻近效应。在酶活性部位，底物之间参与反应的基团或键靠近，使反应易于进行，这就是定向效应。底物的形变和诱导契合底物与酶结合后，发生构象变化，相应的键变得对反应更敏感，降低了反应的活化能。（distortionandinduced-fit）酸碱催化酶活性部位的催化基团可以通过向底物提供质子或从底物上夺取质子，而催化反应。若提供质子和夺取质子的是反应液中的H+和OH－，称为专一酸碱催化或狭义酸碱催化；若提供质子和夺取质子的是酶活性部位的残基，称为总酸碱催化或广义酸碱催化。（acid-basecatalysis）一些氨基酸残基的广义酸碱形式共价催化共价催化分为亲电催化和亲核催化两种类型。亲电催化指的是酶活性部位的催化基团在催化反应过程中汲取底物的电子，产生底物与酶共价结合的过渡态中间物；亲核催化是酶活性部位的催化基团在反应过程中向底物供给电子，产生底物与酶共价结合的过渡态中间物。（covalentcatalysis）金属离子催化金属离子带正电荷，它可以稳定底物过渡态中间物中的负电荷，还可以通过吸引电子，造成电子畸变，使得反应容易进行。（metalioncatalysis）活性部位微环境的影响在实际催化中，上述多种因素可以协调起作用。多元催化和协同效应活性部位是一个疏水环境，介电常数较低，带电基团之间的作用力较强，有助于催化基团与底物的作用。四、酶催化反应机制的实例溶菌酶溶菌酶能够水解细菌细胞壁的多糖，从而溶解这些细菌的细胞壁。细胞壁多糖是N-乙酰氨基葡糖（NAG）-N-乙酰氨基葡糖乳酸（NAM）的共聚物，其中的NAG和NAM通过β－1,4-糖苷键交替排列。（lysozyme）细菌细胞壁多糖溶菌酶的一级结构红箭头所指为活性部位残基分子量为14.6×103溶菌酶催化反应的特异性溶菌酶能够水解NAM的C1与NAG的C4之间的糖苷键，但不能水解NAG的C1与NAM的C4之间的糖苷键。几丁质是甲壳类动物甲壳中所含的多糖，仅由NAG残基通过β－1,4-糖苷键相连，溶菌酶也可以水解几丁质。溶菌酶催化水解的糖苷键溶菌酶的有效底物酶的活性部位有一条沟，正好能容纳6个多糖残基形成的链。当用含不同残基数的寡聚NAG作实验，发现当残基数达到6个时就可以作为有效的底物。底物（浓度为10－4mol/L）相对水解速率(NAG)20(NAG)31(NAG)48(NAG)54000(NAG)630000(NAG)830000溶菌酶活性部位的催化位点通过研究发现，若将6残基寡聚糖作为溶菌酶的底物，将这6个残基分别称为A，B，C，D，E和F，则水解发生在D和E之间的糖苷键上。其中D糖的吡喃环因空间构象的原因，必须由正常的椅式构象转变成能量较高的半椅式构象，其C1参与的糖苷键稳定性降低，易于断裂。吡喃糖环的椅式和船式构象溶菌酶底物的半椅式构象半椅式构象椅式构象溶菌酶活性部位的催化位点糖苷键的断裂位点在H218O中反应，可以发现D糖的C1上含有18O，而E糖的C4羟基只含普通O。由此可知这个键断裂在D糖的C1和糖苷键的O之间。溶菌酶的催化基团分析D-E键周围的微环境，最活泼的基团是Asp52和Glu35，它们分别位于被断裂的糖苷键的两侧。Asp52在一个极性环境中，而Glu35位于非极性区。在溶菌酶水解几丁质的最适pH下（pH5），Asp52的侧链羧基为解离状态COO－，而Glu的侧链羧基为质子化的COOH形式。溶菌酶的催化机制Glu35酸催化Asp52的负电荷稳定正碳离子丝氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶是一个蛋白酶家族，这个家族包括胰蛋白酶（trypsin）、胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）、弹性蛋白酶（elastase）、凝血酶（thrombin）、枯草杆菌蛋白酶（subtilisin）、纤溶酶（plasmin）、组织纤溶酶原激活剂（tissueplasminogenactivator，tPA）等。它们的共同特征是活性部位有一个必需的丝氨酸残基。消化作用的丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶虽然都是裂解肽键的，但它们的专一性明显不同。胰蛋白酶裂解碱性氨基酸的羧基形成的肽键，胰凝乳蛋白酶裂解芳香氨基酸的羧基形成的肽键，弹性蛋白酶专一性较弱，它主要裂解小的中性氨基酸的羧基侧肽键。这3种蛋白酶有相似的一级结构和三级结构。三种消化蛋白酶的一级结构比较胰凝乳蛋白酶的三维结构胰凝乳蛋白酶分子是一个紧密的椭球体，大小为5.1×4.0×4.0nm。多数芳香和疏水残基包埋在蛋白质内部，而多数带电的或亲水的残基分布在分子表面。3个极性残基His57、Asp102和Ser195在活性部位形成催化三联体（catalytictriad）。这三个残基在胰蛋白酶和弹性蛋白酶中也存在，但这三种蛋白酶的底物结合部位形状不同，导致它们裂解不同氨基酸羧基侧的肽键。胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶的底物结合口袋TrypsinChymotrypsinElastase胰凝乳蛋白酶与eglinC的结合蓝色带状物为eglinC(水蛭蛋白酶抑制剂)蓝色His57红色Asp102黄色Ser195人工底物对一些底物是大分子聚合物的酶，在研究其动力学时，一般使用小分子的人工底物。乙酸-p-硝基苯酯是一种特别有用的模式底物，因为其水解产物对硝基苯酚在400nm有强的光吸收，便于监测其变化。研究胰凝乳蛋白酶的人工底物乙酰苯丙氨酸甲酯苯甲酰丙氨酸甲酯甲酰苯丙氨酸甲酯乙酸-p-硝基苯酯胰凝乳蛋白酶催化机制的动力学研究当大量胰凝乳蛋白酶用乙酸-p-硝基苯酯为底物进行动力学研究时，反应分两个不同的阶段，反应开始时以突发的速率生成p-硝基苯酚，随后出现一个较慢的稳态速率。这是因为反应的第一步是底物与酶结合后，反应释放出p-硝基苯酚，另一个产物乙酸以乙酰基的形式结合在酶活性部位的Ser195上。第二步是水分子攻击乙酰－酶复合物，释放出乙酸根离子。第二步较缓慢，是限速步骤。胰凝乳蛋白酶同底物反应的动力学曲线酰基－酶中间物的迅速形成后缓慢释放产物胰凝乳蛋白酶的催化三联体胰凝乳蛋白酶中催化三联体的作用在没有底物时，His57是未质子化的，当Ser195羟基氧原子对底物进行亲核攻击时，His57从Ser195接受一个质子。Asp102的COO－的作用是稳定过渡态中His57的正电荷形式。此外，Asp定向His57，保证从Ser195接受一个质子后的His57处于适当的互变异构形式。His57的互变异构胰凝乳蛋白酶的催化机制Ⅰ胰凝乳蛋白酶的催化机制Ⅱ五、酶活性的调节控制别构调控（allostericregulation）酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后,酶发生构象改变，进而改变酶活性状态，称为酶的别构调节。具有这种调节作用的酶称为别构酶（allostericenzyme）。凡能使酶分子发生别构作用的物质称为效应剂或别构剂，能增加酶活性的别构剂为别构激活剂，能抑制酶活性的别构剂为别构抑制剂。天冬氨酸转氨甲酰酶（aspartatetransca