第四章 发酵培养基的灭菌与无菌空气的制备

第四章发酵工厂灭菌与无菌空气制备第一节发酵培养基灭菌第二节空气的净化除菌第一节发酵培养基灭菌基质或产物被杂菌消耗损失，造成生产能力下降。杂菌的某些代谢产物改变了培养液的某些理化性质，造成产物分离提取困难，产物收率降低或品质下降。杂菌大量繁殖，改变了反应介质的pH，使生物反应发生异常变化。杂菌分解代谢产物，导致生产失败。菌体污染，导致细胞破裂，使生产失败等。一、消毒与灭菌的原理和方法1、发酵工业染菌的危害2、消毒与灭菌消毒：采用物理或化学方法杀死容器、器具内外、车间、厂区等环境中的病原微生物，但一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌的芽孢。灭菌：采用物理或化学方法杀死或除去物料、空气、容器、器具等环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。3、发酵工业中灭菌和消毒常用范围：为保证纯种培养，在生产菌种接种培养之前，要对培养基、空气系统、消泡剂、流加物料、设备、管道进行灭菌；还在对生产环境进行消毒，防止杂菌和噬菌体的大量繁殖。4、控制有害微生物的方法：5、除菌的方法加热灭菌（包括常压或蒸汽高压加热法，培养基）空气的过滤除菌紫外线或电离辐射（环境）化学药物灭菌（表面、器具）（1）热杀菌作用的种类高温致死原理：使微生物的蛋白质和核酸等重要生物高分子发生变性、破坏。例如它可使核酸发生脱氨、脱嘌呤或降解，以及破坏细胞膜上的类脂质成分等。A、干热灭菌法将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热烘箱内，在150～170℃下维持1～2小时后，即可达到彻底灭菌的目的。在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。灼烧，是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。B、湿热灭菌法湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。这一方面是由于湿热易于传递热量，另一方面是由于湿热更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，从而加速其变性。多数细菌和真菌的营养细胞在60℃左右处理5～10min后即可杀死；酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用80℃以上的温度处理才能杀死；而细菌的芽孢最耐热，一般要在120℃下处理15min才能杀死。a、常压法巴氏消毒法（pasteurization）：用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法，其主要目的是杀死其中无芽孢的病原菌（如牛奶中的结核杆菌或沙门氏菌），而又不影响它们的风味。巴氏消毒法是一种低温消毒法，有：低温维持法：在63℃下保持30分钟可进行牛奶消毒；高温瞬时法：用于牛奶消毒时只要在72℃下保持15秒钟即可。间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。方法是：将待灭菌的培养基在80～100℃下蒸煮15～60分钟，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或37℃下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。b、加压法常规加压灭菌法盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底驱尽后将锅密闭，再继续加热至121℃（压力为1kg／cm2或15磅／英寸2），时间维持15～20分钟，也可采用在较低的温度（115℃，即0.7kg／cm2或10磅／英寸2）下维持35min的方法。此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。c、连续加压灭菌法在发酵行业里也称“连消法”。此法只在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。主要操作：将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。培养基一般在135～140℃下处理5～15秒钟。二、高温对培养基成分的有害影响及其防止1、高温对培养基成分的有害影响2、消除高温有害影响的措施（1）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；（2）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；（3）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌（在112℃即0.57kg／cm2或8磅／英寸2下灭菌15分钟）或间歇灭菌；（4）在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌。（5）其他注意事项在配制培养基时，为避免发生沉淀，一般应按配方逐一加入各种成分。另外，加入0.01％EDTA或0.01％NTA（氮川三乙酸）等螯合剂到培养基中，可防止金属离子发生沉淀。最后，还可以用气体灭菌剂如氧化乙烯等对个别成分进行灭菌处理。1、高压蒸汽灭菌设备（灭菌锅）：手提式灭菌锅：容量小，多用于母种培养基灭菌。立式或卧式灭菌锅：较大，多用于原种或少量栽培种培养基的灭菌，一般能装几十瓶或几百瓶。灭菌柜：和蒸汽锅炉配套，用于大量的原种和栽培种培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶(袋)。但投资太大，适合大型菌种场使用。三、灭菌设备2．常压蒸汽灭菌锅常压蒸汽灭菌锅是用铁锅、砖、水泥砌成的，造价低，适于一般生产单位和专业户使用。大小可根据需要而定，但最大的锅每次装料也最好不超过500公斤。3．烘箱烘箱主要是用于玻璃器皿的干燥和灭菌，也可用于其它物品烘干。四、培养基的灭菌1、湿热灭菌的基本原理：湿热灭菌是直接用蒸汽灭菌。蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强有强大的穿透力，在高温和水存在时，微生物细胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性变性，致使微生物在短时间内死亡。由于湿热灭菌有经济和快速等特点，因此被广泛用于工业生产。用蒸汽加热的方法对培养基灭菌的要求是:既要达到一定的灭菌程度，又要尽量减少营养成分的破坏。2、理论灭菌时间某些分子的分解和分子内部的重新排列的反应属于单分子反应（符合一级反应动力学的规律）。杂菌虽然是一个复杂的高分子体系，但其受热被杀死，主要原因是高温能使蛋白质变性，这种反应属与单分子反应，因此杂菌在一定温度下受热死亡也遵循单分子反应方程（一级反应动力学方程）。τ=(2.303/k)log(No/Ns)τ---灭菌时间（秒）k---反应速度常数，与菌的种类和加热温度有关（s－１）No---灭菌开始时，污染的培养基中杂菌个数（个／ml）Ns---经过灭菌时间T后，残存活菌个数（个／ml）细菌名称K值/min-1枯草芽胞杆菌3.8-2.6硬脂嗜热芽胞杆菌FS15180.77硬脂嗜热芽胞杆菌FS6172.9产气梭状芽胞杆菌PA36791.8（1）微生物的热死定律----对数残留定律（2）灭菌温度与菌死亡反应速度常数的关系k=Ae-E/RTK——菌死亡的速度常数（1／秒），当反应物的浓度为单位浓度时，则反应速度常数在数值上等于反应速度A——阿累尼乌斯常数（1／秒）R——气体常数（1.987*4.817焦／开／摩尔）T——绝对温度（开）SRTENNeA0ln1将上式代入SNNk0ln1，得：灭菌时间的计算例：有一发酵罐，内装培养基40m3，在131℃的温度下进行连续灭菌。设每毫升培养基含有耐热菌的芽孢2×107个，在131℃时的灭菌速率常数为0.25s-1。试求灭菌失败的机率为0.001所需的时间。解：(min)7.2ln1)(25.0(001.0)(10810210400114760SSNNktskNN个）个3、影响培养基灭菌时间的因素（选择杀菌方式）（1）pH值的影响pH值对微生物的耐热性影响很大，pH为6.0-8.0时微生物最不易死亡，pH6.0时氢离子易渗入微生物的细胞内。（2）培养基成分培养基的成分中，油脂、糖类、蛋白质都是传热的不良介质，会增加微生物的耐热性，使灭菌困难。浓度较高的培养基相对需要较高温度和较长时间灭菌。高浓度的盐类，色素则削弱其耐热性，故较易灭菌。（3）培养基中的颗粒物质培养基中的颗粒物质大，灭菌困难，反之，灭菌容易。一般说来，含有颗粒对培养基灭菌影响不大，但在培养基混有较大颗粒，特别是存在凝结成团的胶体时，会影响灭菌效果，必须过滤除去。（4）灭菌物体含菌量的影响。天然原料尤其是麸皮等植物性原料配成的培养基，一般含菌量较高，而用纯粹化学试剂配制成的组合培养基，含菌量低。（5）灭菌锅内空气排除程度的影响检验灭菌锅内空气排除度，可采用多种方法。最好的办法是灭菌锅上同时装有压力表和温度计，其次是将待测气体通过橡胶管引入深层冷水中，如只听到“扑扑”声而未见有气泡冒出，也可证明锅内已是纯蒸汽了。（6）灭菌对象的体积要防止用常规的压力和时间在加压灭菌锅内进行大容量培养基的灭菌（存在死角）。（7）加热与散热速度这两段时间也对灭菌效果和培养基成分发生影响。在灭菌操作中对这些技术细节都应加以注意。4、灭菌的实际操作（1）空罐灭菌空罐灭菌也称空消。无论是种子罐、发酵罐、还是尿素（或液氨）罐、消泡罐，当培养基（或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌，为空罐灭菌。为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢，空罐灭菌要求温度较高，灭菌时间较长，只有这样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。将培养基置于发酵罐中用蒸汽加热，达到预定灭菌温度后，维持一定时间，再冷却到发酵温度，然后接种发酵，这叫做实罐灭菌，又称分批灭菌。操作要点：三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。这就是所谓的“三路进气”。（2）实罐灭菌将配制好的培养基向发酵罐输送的同时加热、保温和冷却。连续灭菌时，培养基能在短时间内加热到保温温度，并能很快冷却，有利于减少营养物质的破坏。液体培养基的连续灭菌一般在由配料罐、泵、连消塔、维持罐和喷淋冷却器的连消设备中进行。（3）连续灭菌培养基连消工艺流程图喷嘴式连消塔喷射加热器喷淋冷却连续灭菌流程薄板换热器连续灭菌流程薄板换热器（4）连续加压灭菌法优点①因采用高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又可最大限度减少营养成分的破坏，从而提高了原料的利用率，比“实罐灭菌”（120℃，30分钟）提高产量5～10％；②由于总的灭菌时间较分批灭菌注明显减少，所以缩短了发酵罐的占用周期，从而提高了它的利用率；③由于蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率；④适宜于自动化操作；⑤降低了操作人员的劳动强度。五、过滤除菌法是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。在体外培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。发酵工业常用过滤除菌方法处理热敏性物料和制备无菌空气。目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。滤膜过滤装置、烧结玻璃滤板过滤器、石棉板过滤器（Seitz滤器）、素烧瓷过滤器以及硅藻土过滤器等。过滤除菌的缺点是无法去除其中的病毒和噬菌体。六、化学杀菌剂或抑菌剂1、表面消毒剂常用消毒剂的种类很多，它们的杀菌强度各不相同。但几乎都有一个共同规律，即当其在极低浓度时，常常会对微生物的生命活动起刺激作用，随着浓度逐渐增高，就相继出现制菌和杀菌作用，因而形成一个连续的作用谱。表面消毒剂是指对一切活细胞都有毒性，不能用作活细胞内的化学治疗用的化学药剂。为比较各种表面消毒剂的相对杀菌强度，常采用在临床上最早使用的消毒剂——石炭酸作为比较的标准，并提出了石炭酸系数这一指标。所谓石炭酸系数，指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为10分钟，而供试菌定为Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）。第二节空气的净化除菌一、空气中微生物的种类与分布空气中微生物的含量和种类，随地区，季节和空气中灰尘粒子多少，以及人们的活动情况而异。北方地区：气候干燥，寒冷，空气中的含菌量较多微生物在环境中分布：离地面越高，含菌量越少（一般每升高10米，空气中的含菌量就降低一个数量级）城市的空气中含菌量较多，农村的空气中含菌量较少，一般城市空气中杂菌数为3000-8000个／米3。空气中微生物种类：细菌和细菌芽胞较多，其次是酵母，霉菌和病毒。存在状态：一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上，空气中微生物的含量一般为103-104个／米3。灰尘粒子的平均大