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荧光免疫技术基本概念•抗原抗体反应具有高度特异性•荧光物质的检测具有灵敏性和直观性•荧光免疫技术是将两者有机的结合起来–将荧光物质与抗原（抗体）连接，形成荧光标记物–再与相应的抗体（抗原）发生反应，检测反应体系中的荧光强弱及存在部位用于物质的定性、定量、定位检测•按技术原理及用途分为–荧光抗体染色技术用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测–荧光免疫测定对体液标本中的抗原或抗体进行定量检测，有均相和非均相两种荧光抗体染色技术•基本原理–在基质片上，通过抗原抗体的反应，连接上荧光素标记的的抗体，借助荧光显微镜观察有无荧光及部位，最终作出定性、定位的判定•技术要求–基质片–荧光抗体–荧光显微镜基质片•将标本固定在玻片上而形成，含有已知或待测抗原•根据标本来源不同可分为–组织印片、组织切片、细胞涂片、细菌涂片•制备好的基质片应尽快染色或置－20℃保存荧光抗体•用化学的方法将荧光物质共价连接在抗体上而形成•荧光的基本知识–自然界某些物质能从外界吸收能量（光能、化学能），外层电子发生跃迁，进入激发态，从激发态回复至基态时，多余的能量以光能的形式释放，产生荧光，可分为光致荧光、化学荧光、X线荧光–荧光物质不会将全部吸收的能量都转变为荧光，在此过程中，吸收能量转变为荧光的百分率称为荧光效率。–荧光物质发射荧光的能力减弱甚至不能发射荧光称为荧光的淬灭–使荧光发生淬灭的因素有：长时间激发光照射、某些化学物质（苯胺、酚、硝基苯、卤化物等）–环境因素对荧光物质产生荧光强度有影响（pH、温度、荧光素的浓度、基质片上的固定剂等）荧光抗体•作为标记的荧光物质应具备的条件–与蛋白质分子能稳定结合，–标记容易，结合后不影响蛋白质活性–荧光效率高–荧光色泽与背景色泽对比鲜明–物质易得，来源广泛荧光抗体•荧光抗体染色技术中常用的标记荧光物质最大吸收波长最大发射波长异硫氰酸荧光素（FITC）四乙基罗丹明（RB200）四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）藻红蛋白495nm570nm550nm490～560nm525nm，黄绿色595nm，红色595nm，红色620nm，橙红色在其他荧光免疫技术中的荧光物质：镧系金属、酶作用产生荧光的物质（MUG）荧光抗体•制备–FITC中含活性基团（－N＝C＝S）在碱性条件下能与蛋白质中赖氨酸的NH2发生反应，使两者共价结合–在碱性条件下（CB），将待标记蛋白质与FITC按一定比例混合，反应一段时间–生成物经分离纯化、鉴定合格后小瓶分装，低温下保存•需去除的有游离的FITC、过度标记的蛋白质、标记的非特异性抗体•按公式计算F/P的值，一般固定标本1.5、活细胞染色2.4为宜荧光显微镜•用于观察荧光的特殊装置–除与普通的显微镜一样能观察细胞、亚细胞结构外，还应有–光源作为激发光，引起荧光的发出–滤光片隔热滤光片、激发滤光片、吸收滤光片–聚光器•观察到的荧光包括–特异性荧光由抗原抗体反应后，荧光抗体结合在基质片上，所发出的荧光–非特异性荧光背景荧光洗涤不彻底，荧光抗体非特异性吸附交叉反应荧光抗体染色法•技术类型–直接法–间接法–补体结合法–双标记法直接法•原理待测标本荧光抗体荧光方法简单、快速、特异，灵敏度低，每检测一种抗原，需制备相应的荧光抗体。常用于细胞、病毒的快速检测、肾活检和皮肤活检间接法•原理已知抗原待测抗体荧光素标记的抗抗体荧光方法灵敏、检测过程中只需制备一种荧光素标记的抗体。常用于自身抗体的检测标记的抗体为针对所检测物种所分泌的免疫球蛋白补体结合法•原理已知抗原待测抗体抗补体荧光方法灵敏、荧光抗体也只需一种，但操作繁琐、影响因素多，不常用荧光素标记的抗体为抗补体的抗体双标记法•原理–用两种不同的荧光素分别标记两种特异性抗体，再与基质片作用后，用荧光显微镜观察，以荧光的颜色来判断相应抗原存在的情况时间分辨荧光免疫测定•基本概念–荧光免疫技术对物质进行检测时，待测物质的含量与生成物荧光的强度存在着量的关系–在激发光照射后一段时间，除特异性荧光外，反应体系中还可能存在着其他非特异性荧光，以这段时间内的荧光强度代表反应体系的荧光强度，会导致结果的偏差–激发光照射后经过一段时间，待非特异性荧光消失，而特异性荧光仍然存在，这时再测量反应体系的荧光强度–标记物应用荧光寿命比非特异性荧光寿命长的荧光素时间分辨荧光免疫测定•标记物–三价镧系(Eu、Sm、Tb、Nd、Dy)金属离子螯合物•荧光特点–荧光寿命长（比非特异性荧光寿命长5～6个数量级）–激发光（340nm）与发射光（613nm）相差大，易分开–激发光谱宽（增加激发能）、发射光谱窄（降低本底荧光）–荧光标记相对比活性高时间分辨荧光免疫测定•技术类型–固相双位点夹心法–固相抗原竞争法–固相抗体竞争法荧光偏振免疫测定•原理–荧光素标记的物质分子量越小，运动越快，被偏振光激发后，发射的偏振荧光越弱，反之–在反应体系中，待测抗原、荧光素标记抗原竞争结合相应抗体，待测抗原浓度高，标记抗原与抗体的结合少，多数以小分子状态存在，被偏振光激发所发射的偏振荧光弱，反之，当待测抗原含量少，标记抗原与抗体结合多，成为大分子，被偏振光激发所发射的偏振荧光强–待测抗原的浓度与偏振荧光强度成反比–该方法为均相免疫测定法