龙血竭抑制大鼠脊髓背角广动力范围神经元诱发放电的药效物质

中国科学C辑:生命科学2008年第38卷第12期:1130~1142龙血竭抑制大鼠脊髓背角广动力范围神经元诱发放电的药效物质郭敏,陈素,刘向明*中南民族大学生物医学工程系,武汉430074*联系人,E-mail:[e-mail]收稿日期:2008-03-03;接受日期:2008-07-24国家民委自然科学基金(批准号:MZY06002)资助项目摘要通过在体动物实验,在整体水平上确证龙血竭的镇痛效应及产生此效应的药效物质.对完整Wistar雄性大鼠模型,采用细胞外微电极记录技术,观察龙血竭及其化学成分剑叶龙血素A、剑叶龙血素B、龙血素B,以及这3种成分的各种组合对电刺激坐骨神经诱发的脊髓背角广动力范围神经元放电活动的影响.应用等效剂量概念,在药物量效关系曲线Hill系数相异的情况下,导出了判定3种药物相互作用性质的相加等效曲面方程.基于这些方程和Tallarida所建立的判定具有不相似量效曲线的2种药物相互作用性质的等效线方程,确定3种成分在不同的组合方式下调制广动力范围神经元诱发放电活动时的相互作用性质.结果表明,龙血竭及其3种成分均对广动力范围神经元的诱发放电频率具有浓度依赖的抑制作用,但描述3种成分量效关系曲线的Hill系数各不相同.各种组合中只有剑叶龙血素A、剑叶龙血素B和龙血素B的组合能够产生与龙血竭类似的抑制效应,且这3种成分在联合抑制广动力范围神经元的诱发放电频率时具有协同作用.上述结果说明,龙血竭能通过3种成分的相互作用在脊髓水平干预痛觉信息的传导和加工,进一步证实了其镇痛效应的药效物质是这3种成分的分子组合.关键词龙血竭药效物质细胞外微电极记录广动力范围神经元药物相互作用龙血竭是传统药物中的一味名贵药材,是多种成分的混合物,具有行瘀止痛、止血敛疮等功效,有“活血圣药”之称.其药理学实验、临床疗效观察以及毒理学实验的结果[1,2],说明龙血竭中产生镇痛效应的化学成分具有开发成一种安全有效、成瘾性低的新型镇痛药物的潜能.本实验室曾以百合科龙血树属(Dracaena)植物剑叶龙血树(Dracaenacochinchinensis(Lour.)S.C.Chen)含脂木材中提取的龙血竭为实验对象,应用膜片钳实验技术,观察到其对与疼痛发生和传导机制关系密切的背根神经节(dorsalrootganglion,DRG)细胞河豚毒素敏感型(tetrodotoxin-sensitive,TTX-S)和河豚毒素不敏感型(tetrodotoxin-resistant,TTX-R)钠离子通道电流具有调节作用[3,4],提出了龙血竭可能通过直接干预外周痛觉信息的传导过程来发挥其镇痛效应的机制.以龙血竭本身对TTX-S和TTX-R钠离子通道电流的调节作用作为参照,比较了龙血竭和其3种化学成分剑叶龙血素A、剑叶龙血素B和龙血素B的各种组合的药理效应参数,所得结1130中国科学C辑:生命科学2008年第38卷第12期果提示龙血竭3种化学成分的分子组合是龙血竭调节DRG细胞TTX-S和TTX-R钠离子通道电流的药效物质[4].在疼痛的传导路径中,DRG和脊髓背角(spinaldorsalhorn,SDH)是痛觉传递的两个重要起始部位.外周的伤害性刺激传入经DRG的中枢轴突可直接传至SDH神经元,通过脊髓丘脑束等神经纤维束传至丘脑再至大脑皮层产生痛觉;组织损伤导致的长时间SDH神经元功能的改变,又可以反过来影响DRG神经元对疼痛的反应.从二者之间的相互关系推测,龙血竭既然能调制离体DRG细胞电压门控性钠离子通道电流,应该也能影响在体SDH神经元的放电活动.以往对龙血竭的药理实验并未涉及药物进入机体后到达靶细胞的过程,药物在机体内发挥作用的过程又比较复杂,所以有必要设计在体动物实验,观察龙血竭通过机体内部复杂的整合、调节后对SDH放电活动的影响,在整体动物水平上对其干预痛觉信息传导,产生镇痛效应的药效物质进行更深入的药效学研究.在SDH中对痛觉信息的传导、整合以及痛觉强度的分辨起重要作用的神经元主要是非特异性广动力范围(widedynamicrange,WDR)神经元[5].本研究以乌拉坦麻醉下的在体大鼠为实验对象,采用细胞外微电极记录的方法,观察龙血竭、其化学成分剑叶龙血素A、剑叶龙血素B、龙血素B以及这3种成分的各种组合对电刺激坐骨神经诱发的WDR神经元放电活动的影响,并对化学成分之间是否存在药效学相互作用进行评估.1材料与方法1.1实验药品的配制龙血竭、剑叶龙血素A、剑叶龙血素B和龙血素B均购自广西中医药研究所,龙血竭为百合科龙血树属植物剑叶龙血树(Dracaenacochinchinensis(Lour.)S.C.Chen.)含脂木材中提取的醇提物,龙血竭及其3种化学成分由卢文杰教授提取、分离、鉴定.3种化学成分的纯度均为98,从龙血竭中提取分离出的剑叶龙血素A、剑叶龙血素B和龙血素B分别占提取终产物的22,11和5.所有药品均用人工脑脊液(artificialcerebrospinalfluid,ACSF)配制,其成分为:NaCl115.0mmol/L,KCl5.6mmol/L,CaCl22.0mmol/L,MgCl21.0mmol/L,glucose11.0mmol/L,NaH2PO41.0mmol/L,NaHCO325.0mmol/L,用1mol/LHCl调pH值至7.4,渗透压至300mOsm/L,上述所有化学试剂均.本实验以0.05龙血竭溶液[4]影响WDR神经元诱发放电活动的药理效应作为比较龙血竭的药理效应和其化学成分(组合)的药理效应的标准.另配制0.005,0.0005,2和54种浓度的龙血竭溶液,分别观察它们的药理效应,据此确定龙血竭药理效应的浓度依赖性.剑叶龙血素A、剑叶龙血素B和龙血素B这3种单体化学成分的溶液浓度以及它们各种组合的溶液浓度,均按照它们各自在龙血竭提取终产物中的百分比含量设定,从而确保各种单体化学成分的溶液和化学成分组合的溶液中所含的各种化学成分与0.05的龙血竭溶液中所含的各种化学成分在含量和质量比例关系上的一致.单体化学成分溶液的配制见表1,化学成分组合溶液的配制见表2.1.2细胞外微电极记录(1)动物手术.实验采用3~4月龄的雄性Wistar大鼠(体重250~300g,武汉大学实验动物中心提供).大鼠用乌拉坦(1.2g/kg)腹腔麻醉后行气管插管术和尾静脉插管术.术后将大鼠移至立体定位架上,俯位固定脊柱T11与L3段,于腰膨大处切开皮肤,使用锥板切除术暴露脊髓T13~L1节段;并在左侧后肢股部切开皮肤,游离坐骨神经约1cm置于刺激电极上;将脊髓周围的皮肤及神经周围的皮肤缝制成2个浴槽,并在浴槽内滴加38℃的液体石蜡,以防止脊髓和表1单体化学成分的溶液单体化学成分与0.05龙血竭浓度浓度/mmol·L−1为计算浓度依赖性所添加的溶液浓度/mmol·L−1剑叶龙血素A0.38(0.011)0.190.7610剑叶龙血素B0.19(0.0055)0.380.7610龙血素B0.08(0.0025)0.0080.8101131郭敏等:龙血竭抑制大鼠脊髓背角广动力范围神经元诱发放电的药效物质表2化学成分组合的溶液所含化学成分浓度/mmol·L−1化学成分组合剑叶龙血素A剑叶龙血素B龙血素B组合10.380.190组合20.3800.08组合300.190.08组合40.380.190.08坐骨神经干燥.术后静脉推注肌肉松弛剂三碘季铵酚(首量:100mg/kg,维持量:30mg/kg,每隔30min注射1次)制动,并上动物呼吸机行人工呼吸(频率:90次/min;吸呼比:1︰2;潮气量:5~6mL),同时将大鼠置于37℃恒温毯上,维持大鼠体温于正常生理水平(直肠温度(37±1)℃),并调整大鼠胸廓的位置以减少脊髓随大鼠的呼吸运动而产生的移动.实验过程中随时观察动物瞳孔大小、角膜反射和皮肤色泽,若上述生理指标异常则立即终止实验.(2)WDR神经元的判定.在大鼠所暴露的坐骨神经同侧的脊髓T13~L1节段,距脊髓前正中动脉旁0.5~1mm处,应用微电极推进器将充灌0.5mol/L醋酸钠溶液,电极阻抗在5~12MΩ范围的玻璃微电极尖端缓慢垂直地插入此处的脊髓背角,插入深度控制在70~1300μm范围内.在微电极推进的过程中,经刺激电极持续向大鼠的坐骨神经施以强度为4~5V,波宽为3ms,频率为1Hz的方波刺激,同时采用BL-420E生物机能实验系统对玻璃微电极引入的电信号进行采样,一旦监测到电刺激坐骨神经诱发的SDH神经元的放电活动,即刻停止电刺激和电极的推进,并在暴露的大鼠坐骨神经同侧后爪上确定其皮肤感受野,于感受野内分别施以非伤害性刺激(用毛刷刷)和伤害性刺激(用镊子捏),如果2种刺激均能引起神经元放电频率增高,且伤害性刺激所引起的放电频率明显高于非伤害性刺激,则产生诱发放电的SDH神经元为WDR神经元[6,7].(3)实验步骤.待WDR神经元放电活动稳定后,再经刺激电极向大鼠的坐骨神经施以一次强度为4~5V,波宽为3ms,频率为1Hz,串长为20s的方波串刺激,以该伤害性电刺激施加的时刻为始点,记录30s的WDR神经元的诱发放电活动作为空白对照.然后,用加样枪向玻璃微电极插入处的脊髓表面垂直滴加10μL的药品溶液,并在加药后2,5,10,15,20,25,30min时刻均施加一次上述脉冲串刺激,从加药时刻起一直观察并记录WDR神经元的放电信号,30min后方可结束记录.一次记录完成后,用人工脑脊液将脊髓表面的残余药液冲洗干净,静息至少30min后,再开始寻找下一个WDR神经元.1.3数据分析WDR神经元每秒的诱发放电个数,即放电频率,可由BL-420E生物机能实验系统自动统计出来.为了比较WDR神经元诱发放电频率在加药前后的时间分布特征,可绘制以每次脉冲串刺激施加时刻为始点的30s内的诱发放电频率直方图.直方图的纵坐标为WDR神经元的放电频率,直方图中每个矩形的宽度为1s.以每次脉冲串刺激施加时刻为始点的30s内的WDR神经元的平均放电频率作为反映其诱发放电活动强弱的指标.统计加药前2min施加方波串刺激WDR神经元30s内的平均放电频率fcontrol并作为空白对照,再统计加药后2,5,10,15,20,25,30min时刻施加方波串刺激WDR神经元30s内的平均放电频率f2,f5,f10,f15,f20,f25,f30.所有实验数据采用SPSS统计软件包进行处理,t,(,)双因素ANOVA,P0.05.所有的数据均用x±SE.WDR(Inhibition),controldrugcontrolInhibition100fff−=×,(1)其中fdrug为加药后WDR.Hill,max50Inhibition1InhibitionIC1hc=⎛⎞+⎜⎟⎝⎠,(2)其中Inhibition为药物对WDR神经元诱发放电频率的抑制率,Inhibitionmax为昀大抑制率,IC50为药物的半数抑制浓度,c为药物的浓度,h为Hill系数.1132中国科学C辑:生命科学2008年第38卷第12期1.4化学成分之间药效学相互作用的评估药效学相互作用是指同时或相继使用2种或2种以上药物时,其中一种药物作用的大小、持续时间甚至性质受其他药物的影响而发生明显改变.根据各组成药物的量效关系曲线可建立零相互作用的相加等效线(曲面)方程,来判定药物间药效学相互作用的性质.药物间的相互作用可被定性为3种情况:即相加、协同和拮抗[8],分别指药物的实际合用效应等于、大于以及小于药物之间相互作用为零时的合用效应.当2种药物A,B单独作用所能产生的昀大效应(Emax)相同,且描述它们量效关系曲线的Hill系数也相同时,A与B的效价强度比(药物产生相同的效应时所需要的剂量之比)是定常的,在这种情形下,基于Loewe与Muischnek的等效剂量概念[9],表明零相互作用的相加等效线方程是:1iiab