文心兰组织培养

兰花是我国的十大传统名花之一，栽培历史悠久。2000多年前就被用来沐浴或随身佩带，被孔子尊之为“王者香草”。唐宋时，春兰﹑建兰等得到了广泛栽培。这一类兰花称为国兰，多为地生兰。相对于国兰而言气生兰称为洋兰。它兴起于西方，种类很多，有蝴蝶兰﹑大花惠兰﹑等。文心兰属Oncidium是兰花中的大属之一，原种约有750多种，大多数为气生种，有部分为半气生种或地生种。文心兰的分布地域广阔，原产于墨西哥，西印度群岛，巴西等地。文心兰的花小而繁多，颜色鲜艳多彩，形态变化多样，因其形似舞女，故有称舞女兰。文心兰的花期因品种而异，花朵连续不断的开放，可持续1-3个月，是上等的切花材料也可盆栽观赏。分株繁殖，一株文心兰一年仅繁殖2-3个芽，繁殖系数低。组织培养繁殖，可以加快繁殖速度，进行工业化生产。早在1967年，Bertch对文心兰茎尖进行了培养，Fast(1973)用具有休眠芽的花梗节段作为外植体，成功诱导形成了再生植株。目前的文心兰组培研究仍存在一些问题。引言文心兰试管苗生产中亟待的问题目前文心兰的组织培养研究仍停留在研究培养基的生化组成成分的阶段，培养的试管苗质量较差，生产成本较高，而且试管苗的销售时间较短，不利于集中生产。满足不了市场要求在限定的期间内（栽培的季节性）大量生产出规格一致的试管苗。因此培养低成本、高质量试管苗，并能短期保存，计划性生产是当前文心兰种苗产业化过程中亟待的问题。原球茎的诱导技术的应用试管苗培养新技术的研究文心兰试管苗苗期调控新技术的应用研究原球茎的高效增殖的研究1.材料实验用文心兰品种为薄叶系文心兰Aloha‘Iwanaga’。茎尖：从母株上切取叶片尚未展开的幼苗，剥去叶片，露出侧芽，流水冲洗；消毒用70%的酒精浸10秒钟，再用8%的次氯酸钠溶液中浸10分钟，用无菌水冲3次备用。花梗：取具有休眠顶芽的文心兰花梗，切取2cm长的顶端部分，去掉叶鞘，进行消毒。用手术刀除去顶芽最尖端部分，切取尖部下面2-3mm的部分进行培养。原球茎的诱导技术的应用2方法培养方式以500ml三角瓶为培养容器，在三角瓶中注入以Gellangum为凝固剂的固体培养基。三角瓶以橡皮塞封口。为增加透气性，橡皮塞在使用前用打孔器钻孔（ф3mm），并贴上直径为5mm的无菌透气膜。进行静止培养。培养基用MS为基本培养基，附加BA(0.5mg/l)及NAA（1mg/l），培养基中添加Gellangum(2g/l),PH均调整至5.3。培养方式置于全自动培养室培养。培养条件中温度：25℃，光强：1700Lx光照时间：每日16小时（16h/d）。原球茎的诱导技术的应用原球茎的诱导技术的应用实验调查项目①灭菌方式实验：去掉叶鞘的花梗用流水冲洗；消毒分别用100%的酒精浸3秒钟；70%的酒精浸3秒钟；70%的酒精浸10秒钟。用无菌水冲洗3次,再用4%的次氯酸钠溶液浸泡10分钟。然后接种到备好的培养基上,每处理接种15个，在设计好的培养条件下培养40天，统计其污染率、枯死率及生存率。②外殖体大小实验：消毒好的茎尖在体视显微镜分别切成0.3mm、0.5mm、1.0mm、1.5mm大小。接种到备好的培养基上,在设计好的培养条件下培养40天，统计其污染率、枯死率及PLB个数。③激素组成实验：消毒好的茎尖接种到备好的培养基上，培养基的激素以BA及NAA各5个组合即0mg/l、0.1mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l及2.0mg/l，交差组成25个组合，每组合接种3瓶，在设计好的培养条件下培养40天，观察分化情况。花梗培养的激素浓度为BA0.045mg/l、0.11mg/l、0.23mg/l，NAA0.093mg/l、0.19mg/l、0.37mg/l，分别组成9个组合，每组合接种3瓶，设计好的培养条件下培养40天，统计其污染率、枯死率及生存率。④接种时间实验：从2002年2月至2002年12月，每月1号接种部分茎尖，在设计好的培养条件下培养40天，统计其污染率及PLB个数。原球茎的诱导技术的应用不同的前灭菌处理对文心兰花梗培养的影响不同的处理后，通过40天的培养观察结果如表3-1所示：表3-1文心兰花梗培养的前灭菌处理注1：A为100%的乙醇、浸渍3秒；注2：B为70%的乙醇、浸渍3秒；注3：C为70%的乙醇、浸渍10秒。用三种不同浓度的乙醇浸渍其生存率均在40%以下，差别不大，生存率过低，污染率过高，最大达53%，因此可与后灭菌处理结合使用。用A处理100%乙醇消毒时，其污染率为20%，是3个处理中最低的，但枯死率最高达40%，说明已对外殖体有一定的伤害，应慎用，尤其不能和其他灭菌方法一起使用。B处理枯死率较高，尚不清楚。C处理效果最好，生存率最高，枯死率最低。在实际使用过程中，还应严格操作程序，改善后灭菌处理方式。灭菌方式接种数/个污染率/%枯死率/%生存率/%A1B2C31515152053534013174033403结果与分析不同外殖体大小对文心兰茎尖培养的影响实验证明，对PLB形成来说在0.3-1.5mm之间茎尖越小，效果越好。表3-2文心兰茎尖大小对茎尖培养的影响注1：PLB为原球茎。表3-2数据可知：当文心兰茎尖的大小依次增大时，污染率逐渐升高，这是由于茎尖越大，灭菌就越不彻底，污染就在所难免；当文心兰茎尖大小为0.3mm时，茎尖枯死率为33%。我们认为当文心兰茎尖过小（0.3mm以下），受伤细胞多而完整细胞少，培养难度较大，但一旦培养成功，分生能力较强。茎尖大小/mm接种数/个污染率/%枯死率/%PLB数1/个0.30.51.01.59775222929403357.00006.01.21.0原球茎的诱导技术的应用原球茎的诱导技术的应用不同激素组成对文心兰初代培养的影响激素的组成不同，对文心兰的初代培养影响是多方面的，它可以影响外殖体分化方向，也可影响污染率、枯死率、生存率。另外它对以后的继代培养中苗的质量影响也较大。不同的外殖体如茎尖、花梗对激素的要求略有差异，结果见表3-3及表3-4：表3-3激素（生长调节物质）对文心兰茎尖培养的影响NAA（mg/l）00.10.51.02.0BA（mg/l）0DPLB3PLBDDS4+DPLBC+PLBDPLB0.10.5S+PLBCCC+PLBC0.52.0C1D2CCCCCCCC注1：C为愈伤组织；注2：D为枯死；注3：PLB为原球茎；注4：S为苗。原球茎的诱导技术的应用由表3-3可见，当BA浓度为0时,NAA浓度为0，文心兰的茎尖枯死；NAA浓度为0.1mg/l到0.5mg/l时，茎尖生成原球茎；NAA浓度为1.0mg/l和2.0mg/l时，茎尖枯死。说明外源NAA对文心兰茎尖培养非常重要，但过高则会引起伤害。同样的NAA处理，BA的浓度加大会减弱NAA浓度过高的影响，分化也更趋复杂。当BA浓度为0.1mg/l时：NAA浓度为0，文心兰的茎尖枯死或生成苗；NAA浓度为0.1mg/l到0.5mg/l时，茎尖生成原球茎；NAA浓度为1.0mg/l时，茎尖生成愈伤组织或原球茎；NAA浓度为2.0mg/l时，茎尖枯死。当BA浓度为0.5mg/l时：NAA浓度为0，文心兰的茎尖生成苗或原球茎；NAA浓度为0.1mg/l到0.5mg/l时，茎尖生成愈伤组织；NAA浓度为1.0mg/l时，茎尖生成愈伤组织或原球茎；NAA浓度为2.0mg/l时，茎尖生成愈伤组织。当BA浓度继续加大至1.0mg/l以上时，其作用就起到了主导地位，NAA浓度从0到2.0mg/l8个组合中，除BA浓度为2.0mg/l时，NAA浓度为0这一组合文心兰的茎尖枯死外，文心兰的茎尖全都生成愈伤组织。原球茎的诱导技术的应用激素对文心兰花梗培养的影响见表3-4：BAmg/lmg/l个%%%NAA接种数污染率枯死率生存率0.450.0931338310.0930.190.370.0930.190.370.0930.190.371514150.0930.0930.09316158743530.0930.0930.0938860021200.0930.0930.093600.0930.0930.0930.0930.0930.0936400.110.23原球茎的诱导技术的应用实验证明，激素浓度对文心兰花梗培养的污染率、枯死率影响较大，全部的污染率在36%～100%范围内，而枯死率在0%-36%之间。从9种不同浓度的激素处理的结果分析如下：当BA浓度为0.23mg/l时，污染率升高，并随着NAA的浓度增加有所降低。枯死率很低或为零。当BA浓度为0.11mg/l时，污染率也随着NAA的浓度增加而降低。以BA、NAA浓度分别为0.11mg/l、0.19mg/l的组合生存率最高，达54%。而BA、NAA浓度为0.11mg/l、0.19mg/l时生存率也达40%。被认为是两个较好的组合。原球茎的诱导技术的应用不同接种时期对文心兰茎尖培养的影响表3-5文心兰茎尖培养对接种时期的影响由表3-5可知：6月～8月为文心兰的茎尖培养生长旺盛期，由于6月～8月气温较高，细胞增殖生长较快，PLB的增殖也随之加快；茎尖的生长速度超过细菌的侵入速度，因此污染率较低；10月～4月是茎尖培养生长缓慢的时期，实验证明该时期接种，污染率高，PLB的增殖较慢。实验过程中还观察到，文心兰PLB在增殖的同时，部分PLB进一步分化形成了幼苗。时期/月24681012接种数/个181514151514污染率/%PLB数/个432.36720753472.63.34.53.42.3返回原球茎的高效增殖的研究1.不同培养容器和培养方式对原球茎增殖的影响实验材料将由Aloha‘Iwanaga’茎尖诱导形成并增殖后的原球茎(PLB)集块在无菌条件下分割成直径2–3mm，均匀一致的小切块作为接种用材料。实验方法①培养方式分别以500ml三角瓶和箱形树脂膜容器（CulturePack以下简称CP）为培养容器，采用五种培养方式进行PLB增殖培养，即：FL·S：以三角瓶为培养容器的固体培养方式FL·L：以三角瓶为培养容器的液体静置培养方式FL·L·S：以三角瓶为培养容栅的液体振荡培养方式CP·S：以CP为培养容器的固体培养方式CP·L：以CP为培养容器的液体静置培养方式②培养基分别以MS和1/2MS作为基本培养基并附加Peptone2g／l和蔗糖20g／l。其中固体培养基中添加2g／lGellangum(U．S．A)作为凝固剂。pH值5.0。培养基量100ml／容器。原球茎的高效增殖的研究③接种方法选取生长较为一致的pLB集块分割成直径为2–3mm大小的切块，按每培养容器2g原球茎，在无菌条件下称重后接入培养容器。每处理重复5次。④培养条件接种完成后放入常规培养室培养，培养条件如下：温度：25℃。光强：1700Lx。光照时间：16h／d。⑤调查项目各处理经35天培养后，调查增殖后PLB鲜重(g)、干重(mg)和PLB分化幼苗数(株／gPLB)等指标，干重测定时，首光将PLB集块放入温度设定为105℃的烘箱内快速烘干30分钟后，再移入60'C恒温干燥箱中继续干燥48小时后称重。原球茎的高效增殖的研究实验结果与分析文心兰PLB在不同培养方式下，经35天培养后的增殖和幼苗分化情况。表4—1不同培养方式及培养基浓度对PLB增殖的影响培养基浓度方式培养接种PLB鲜重/g培养后鲜重/g生长比1培养后干/mgPLB分化幼苗数2/gPLBMSFL·S2.08.1d4.1d340.8e5.3aFL·L2.07.7d3.4d319.6e2.2bFL·L·S2.010.3cd5.2cd424.4d2.0bCP·S2.010.5cd5.2cd513.6c4.9aCP·L2.011.8c5.9c538.2c1.1c1/2MSFL·S2.012.7c6.4c523.2c4.6aFL·L2.011.3c5.8c449.7cd1.9dFL·L·S2.015.2b7.6b636.5b1.9bCP·S2.016.1ab8.1b859.8a4.5aCP·L2.019.7a9.4a906.2a1.3c原球茎的高