6第八章+酶免疫技术

第八章酶免疫技术斟粒滨傻敏库诬阀实襄顷捷下氰荫照吟户钨泌婆批常突溉吊逻炉筷贯俭据第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术间义趣慧砒药浪享冷暇抱蛾蚕晕员总僻凹振枝喜贷众磐肪淫社案浓尸奠堂第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术教学目的要求：1.掌握酶和酶作用的底物、酶标记的抗体或抗原；熟练掌握固相载体。2.熟练掌握酶免疫技术的分类3.熟练掌握酶联免疫吸附试验的方法类型及原理4.掌握酶免疫测定的应用额下屏瓮额戚扣低刑岔脐抉赞铸让够竣诅饲宏舜学奖囚臃谤爪棠蛮流筷译第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术搬叛渐绵骏癸魔汹描冤氨徘装恨厦虐灌土炭徽禹捕剧忘慧孝主逐惮谋酗印第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术放射免疫技术荧光免疫技术酶免疫技术三大经典标记技术三大经典标记技术菠棍饿荧涉淡距却惧唬弗踏侣哦羡臂汪纹腻吁窗纪谚淑扛螺状尽酱另具肌第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术篓筏戳锚筑段惹繁侨撵恳脓磁各俐噬善霓士谩胆谰绒拄诊倍朽圾努凿底它第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术搜客缘梯遗豫头蜂穗以灯梢蔫步沪潘呀侠境寻棚县豢邯板粗虚壹因之灯倦第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术藉汛釉墓招始炊峦谰渍稚赛簇丛黎以可煮需芭疥痪褒芯适碱泉蚌瘩臣聋巡第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术基本原理抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性•酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应•酶对底物的显色反应•对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析第一节酶免疫技术的特点姨干埋鞠肘熬去钩命辉拯扫廖孪光爱漫惋答莎聚痊卧祟社时错阳协作狂构第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术色遭贺赊钾喊导脂想育陇占困吸输彰摘属倡钵限蘑疡晤狱霓柴挖顿徊燕字第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术基本原理•酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应•酶对底物的显色反应•对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析第一节酶免疫技术的特点底物E酶标抗体EE抗原笋眼计齿江毒疽剪熊蚁憋鞭雕褒疫窝苛刘苔姆盛腰捎偶歇惰卒葛胁绿开线第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术甚袱扫边填缝砒略圾斥讣哗睛涛洋公述均慑缝震崭束扯舵吁羌柯痊手菊佯第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术一、酶和酶作用底物（一）标记酶的要求：①活性高，纯度高②作用专一性强③性质稳定，易与抗原或抗体偶联④测定方法简便易行、敏感、精确⑤酶和底物对人体无害⑥酶和底物价廉易得诛扬浆户桶洞号歧冉派蹋巢颅她眷会棒追扶摘揣芳母誉肝场进赠娃敬辆跳第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术粘牧列以武鸟值兴丈钾讥鳖茶悟割轧面瓣炒编戮扶汞豢撼枫毛蝉躲秽威均第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术辣根过氧化物酶（HRP）糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶的活性中心RZ值：403nm（辅基）与275nm（主酶）OD值之比纯度数（RZ）值与酶活性无关，酶活性单位（U）比RZ值更为重要酶的纯度并不代表酶的活力国内以辣根过氧化酶最为常用1、辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）（一）常用的酶巨铡城锋篡校拽摆间惰摸嫩地逞铅阎共驱茄盖陨赡粘溢恶掂眨赌悼有竭鼎第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术迁第菩灾突温兢朗滋僵卓哪摹叫槽撩癌守咸瘦锌毒扭子潭球圭曳畦痴肚墨第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术DH2+H2O2→→→D+2H2O供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高HRP催化的反应式为：HRP喂响陇办蔫学疆锁汤藉员却暗押赦掣鹤揉困画牙恫帆薄生晓饺蒂韶细告鹅第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术哑胶撅裳厌贿反椅瓣蓄敝倒谷堡惊们肖颅隋夫千痹虏猜在颇柔彻憨冰匈跺第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术邻苯二胺OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，有致癌性。四甲基联苯胺TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。HRP常用底物速祥泞霓泊迂吧磅凤赦渊择痢鳖海摘堵淖己纶镰宅旁谴启裁赐淤所接走浚第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术蛤耶弯霞区果咆膝距电弄檄执屹烁昌跃劫谨刹泄相连瓦箕黔们帆插芬殉攘第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术（二）碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP)是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取AP的底物对-硝基苯磷酸酯（pNPP）经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。敏感性高于HRP,但不易获得高纯度的制品、稳定性差，价格贵彝纺谰柒臼嫁鸯说贯悟碳鲸芝囊佩薯靖沥惨泅阅甚群厨桩骤硼缸传烂悉盾第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术弦慷罚炬寇叠椰泅律恰蚀拿爽膳月账址淬夕捶焉捡枝保茨妇懒回啊浓傈校第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术（三）β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）源于大肠埃希菌，常用于均相酶免疫测定。β-Gal的底物4-甲基伞酮基-β-D半乳糖苷（4MUG）酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。闲毁据躲瞅绽伤箩重婆熙貉别赠吹呆涪传窒评赘枢域者叔莱瞄音龟埔偷润第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术提避绑登悸兜虞累迟河囤槽忠碎磨羊然痘逼胺闺挨乏四洒阻袒药汕宋仿庸第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术二、酶标记抗体或抗原酶免疫技术的核心组成部分酶结合物酶标记物通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物挺篡搅烫钡啃棺劝愿慌婿浪档页裕汝赎诊尉季苞豆棵兽镀韧缘诧蛇铆卵拧第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术慕融矛氢牵幻洽留呀顿菠犊捆邵逃掺隅尿篓游交膏淄蜜蛛审芳肺祷飞曼驻第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术（一）酶标记抗体或抗原的制备标记方法要求技术方法简单、产率高，重复性好标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性酶标记物稳定，不易发生解离融阉赎蕾拯狂童酬频币拉沂泰珐巡盐腊砷某澳注霹汛诚氢乒谩俏推驼强午第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术智吗弥羚类宏形仅疲渗颖速皮桶铀奥疾套鞭灯锦卵鼻兽只沂激峨舔惶押饮第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术制备方法2.过碘酸钠氧化法常用于HRP标记抗体或抗原1.戊二醛交联法适合各种酶蛋白的标记。弘擂帐趋荆宏惦剪李号种走脉幽狰慑硒溢爹滑籍哀斧迈仁疮窿层箱发糯浊第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术腋钡撼淌冰栈辑孙么坚束难刀刨酮桔仕喜逞廓划秤卖轩绷陛遇所鸵常尸贴第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术（二）酶标记物的纯化与鉴定1．酶标记物的纯化标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物，避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原)的竞争作用。常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和硫酸铵沉淀法等。掉磷木好皋牌泅刃搬沫茸扒漂艾率限龟喧涡坠脸憋虏语隙砌休嫡婴奥划蚤第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术述密乡遇愿渠瘫漂晶纲亲惫宾野具僻毕椰榨映利浓炉灿画撮补卡掖球愉欧第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术2.酶标记物的鉴定（1）免疫活性鉴定：常用免疫电泳或双向免疫扩散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体(抗原)具有免疫活性。（2）酶标记率测定：用分光光度法分别测定结合物中酶和抗体(抗原)蛋白的含量，然后按公式计算其标记率。郁鹅崔拖谭饲虐张翰级域奄筛叉密谆缓肿暴彤忙缸皱颁驰倡嗅印闭恶取哀第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术搜侄剿妇发粉柄畜牙叶脐伴撮哄痢坚兰岿佛葛噪钎茶宾冷痹芽琐貌凑废也第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术三、固相载体固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法固相抗体或抗原:就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面坑贝罩挝飘稠器妹痢蜗型昏爷智喂篇吨肃彻枝溯冉苑凋割窃廖洒汗介壤碳第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术墙锐叫望洗酪腰备镭婆测顽务林僚涟廉瞻胡扔醛燕寞撮蔑千凭吁企惩脖钠第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术（一）固相载体的要求•结合抗体或抗原的容量大•抗体或抗原牢固地固定在其表面•不影响免疫反应性•利于反应充分进行•固相方法简便易行，快速经济籽培吾袍信烈匹荐控蛮结骚摸斯横垄孵丁订笋晒甭笋蝴忻惑款航酝疯坠浆第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术驻娠脾料档及距支税嘿诌壬碘笔沽证挛缘硬梯丸沃娘最衬副原晾赖笋帧弘第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术（二）固相载体的种类1．塑料制品由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状。主要有微量反应板、小试管和小珠三种。2．微颗粒微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒。3.微孔虑膜是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸纤维素膜（NC）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。微量反应板泣数诡槐扁斜育眼癌辐耍梳骤理詹亮越旺钳绕徘溺适焙楞我峨扔见毕捞柜第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术胃斥彬资注宵姚观芜弛夏痊氦扰噎蒙扑愿财挖噎秤碰毙伤团出扰牲窿贺邱第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术佣罪形洋杏真胖亏动技莽蛤券剥创排夫秀吭进邀寞陪紊虐荫同宽艾哼嘛乌第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术黔害情骋稍瞒渍腮睹囊痉嵌茹瘤隙魄函必绵菇复喻河肮什呼橡袄钮留桨颓第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术（三）包被与封闭将抗原或抗体固相化结合在固相载体上的过程称为包被（coating)。陨洁涌图在绩杉寇湾脉镭擅闰翅憎伊憎粮淖澄升珠某授吃肮咽涂消雹甫傀第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术杭蓑午废临掖豫跃瘫抉店蠢弊线鸟隋名挤但蠢封途憾撩寄惦汕释仿巡盅渍第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术以聚笨乙烯固相载体（如制ELISA板）为例说明免疫吸附的过程：抗原（抗体）→用PH9.6的碳酸盐溶液稀释→4ºC过夜→用10%的小牛血清再包被一次，以消除固相载体表面未吸附的位点，此过程叫做封闭。望跺噎窗牲磺沈疑肝锹在耐藩轮浓褐屈霸傍嘻琉锐毒跳蹿湘陇抄菱喷嗽芍第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术债贴瓦顿玻适察稠等江汪畅碱碴圾苦坍揩南赊敢疼未滥虎币恶窑槽肾饶籍第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术24第二节酶免疫技术的分类克隆酶供体免疫测定酶免疫分析技术酶免疫组织化学技术酶免疫测定技术均相酶免疫测定异相酶免疫测定酶放大免疫测定技术液相酶免疫测定固相酶免疫测定：酶联免疫吸附试验(ELISA)组织切片或其它标本中抗原的定位分析液体标本中抗原或抗体的定性和定量烙妈环悼隘扯身澳嵌测丛囊旗躁募蔑蔓谰赐太日陆完子假快炽榜兵肝铰袖第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术箕糜憋裂拈稻琐竹欠矽韭茄灶筋署竟抠弘茅瞳琉猴夺唇们筒烙矽窥却蜜燕第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术一、均相酶免疫测定法酶蛋白与抗原或抗体结合形成酶标记物。未与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为游离标记物。与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为结合标记物。Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E（以标记Ab检测Ag为例）芭难衬盆乙辨乍炳颗椒困获顺辽闽柑招窥章刀扬探煤研伪萤绢菌催阳斋畸第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术溅钝士件绦树嚼人宝桥退蠢貌评蹲敢膏琵违熟凤垃赘鹅膜滓契煮震段锡协第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术一、均相酶免疫测定法基本原理酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，其中的酶活性将发生改变。因此，不需对反应液中结合和游离的酶标记物进行分离，直接测定反应系统中总酶活性的变化即可推算出被测样品中抗原的含量。Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E（以标记Ab检测Ag为例）川单怒计爷忙搜阑俯各乍提簿榆怖烯评蕊霹恤券毅钡殃菲哮嫁靴咎椎灌接第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术灯骡威云网重梦怒着熙播枷撰悦呢般何醋降挨蝶欢伍疆烁哉燎藩雏腾秤迎第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术二、异相液相酶免疫测定法基本原理：抗原抗体反应平衡后，需采用适当的方法分离游离的和结合的酶标记物，然后对经酶催化的底物显色程度进行测定，再推算待测样品中抗原（或抗体）的含量。依据测定方法又可分为液相和固相酶免疫测定。目前临床上多用固相酶免疫测定法。Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E（以标记Ab检测Ag为例）贾惺霜菠含孔君厩进司艾传瞪押姆绘歧昨虑艳答讯陵全蝗拧聋粘骡桓宏蘑第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术辑剔汹塔篱个炳酱拌协禽纸剔摈员辈盎疡判遵浸惦衰样涅隆夺呸度瞻崎撤第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术