6第六章基因克隆操作过程

第六章基因克隆操作过程ChapterVITheManipulationProcedureofGeneCloning2020/2/161基因克隆操作过程授课教师：王斌基因克隆操作过程概述2020/2/162基因克隆操作过程VectorTargetgeneRestrictionendonucleaseVectorTargetgene酶切VectorDNAligase连接转化扩增筛选2020/2/16基因克隆操作过程3目的基因的体外重组——酶切和连接（切、接）重组DNA分子的转化和扩增（转、增）目的基因转化子的筛选和鉴定（检）2020/2/16基因克隆操作过程4本章主要内容目的基因的体外重组——切与接重组DNA分子的转化和扩增——转与增目的基因转化子的筛选和鉴定——检教学目的及要求理解基因工程各操作步骤的原理。掌握基因工程克隆目的基因的基本操作。重点：目的基因转化子的筛选方法。应用：能够根据一定的研究目的，确定基因克隆的策略，并设计其技术路线。一、目的基因的体外重组——切与接2020/2/165基因克隆操作过程InvitroRecombinationofTargetGene——DigestionandLigation1.Digestionbyrestrictionendonuclease（切）2020/2/166基因克隆操作过程目的获得线性化目的基因片段、线性化载体作用对象目的基因片段、载体工具：限制性核酸内切酶TargetgeneVectorEcoRIPvuII2020/2/167基因克隆操作过程PstI2020/2/168基因克隆操作过程各种限制酶酶切反应所使用的buffer（Takara）双酶联合酶切所使用的buffer（Takara）单酶切实例2020/2/169基因克隆操作过程双酶联合酶切实例2020/2/1610基因克隆操作过程2.LigationbyDNAligase（接）2020/2/1611基因克隆操作过程目的获得含有目的基因的重组分子作用对象线性目的基因片段、线性化载体工具：DNA连接酶Vector5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'GCTTAAAATTCG5'5'GCTTAA5'5'AATTCG5'GCTTAAAATTCG5'GCTTAA5'AATTCGGCTTAAAATTCG5'GCTTAA5'AATTCGGAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAGEcoRI退火T4-DNAligase获得连接方向不同的两种产物需要鉴定目的基因的连接方向（1）单酶切产生的粘性末端的连接2020/2/1612基因克隆操作过程•同尾酶：能切割产生相同末端的限制性内切酶。•同尾酶是不同的酶，它们只是切割DNA产生的末端相同，同尾酶之间的识别序列可以相同也可以不同。•基因工程中识别序列不同的同尾酶的应用性最大。（2）同尾酶生产的粘性末端的连接Takara网站提供的同尾酶信息2020/2/1613基因克隆操作过程5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'5'TACTAG5'5'GATCAT5'GCCTAGGATCCG5'TACTAG5'GATCAT5'TGATCAACTAGT5'GCCTAGGATCCG5'TACTAG5'GATCATTGATCCACTAGG5'5'GGATCACCTAGTTGATCCACTAGG5'5'GGATCACCTAGTBclIBamHI退火T4-DNAligase获得连接方向不同的两种产物需要鉴定目的基因的连接方向目的产物中对应位置的序列不再是原来的酶切位点2020/2/1614基因克隆操作过程5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'5'CTGCAGGACGTC5'5'CTGCAG5'GACGTC3'3'切平5'CG5'GC补平5'GGATCCCTAGGATCC5'CTAGGCGATCCGCTAGG5'5'GGATCGCCTAGCCGATCCGCTAGG5'5'GGATCGCCTAGC（3）不同粘性末端的连接PstIBamHIT4-DNApolymeraseKlenowT4-DNAligase获得连接方向不同的两种产物需要鉴定目的基因的连接方向；2020/2/1615基因克隆操作过程目的产物中对应位置的序列不再是原来的酶切位点（4）双酶联合酶切产生的不同粘性末端的连接CTGCAGNNNNNNNNNGGATCCGACGTCNNNNNNNNNCCTAGGCTGCAGATCCGGPstIBamHIPstIBamHIGGATCCCTGCAGCCTAGGGACGTCGATCCCTGCAGG退火CTGCAGGGATCCGACGTCCCTAGGT4-DNAligaseCTGCAGGGATCCGACGTCCCTAGG连接产物中目的基因的方向是确定的2020/2/1616基因克隆操作过程5'G3'C5'C3'GGTTTTTTTTTT3'CC3'TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA3'GG3'AAAAAAAAAACC3'GGC3'5'5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG5'5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGGTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGTTdTdTTPTdTdATP退火T4-DNAligase加热S1nuclease（5）平末端的连接2020/2/1619基因克隆操作过程5'5'GGATCCCCTAGGT4-DNAligaseGATCC5'G5'GCCTAG5'5'5'GGATCCCTAG5'GATCCCTAGG5'5'BamHIKlenow补平（6）粘性末端的更换GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinkerGGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5'5'EcoRI2020/2/1620基因克隆操作过程DNAligase介导的体外连接实例2020/2/1621基因克隆操作过程3.重组率重组率：指在基因重组实验中，获得的有目的基因的重组分子数的数目，占载体分子总数的百分比。在常规实验条件下，重组率一般为25-75%重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。提高重组率的方法提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1-10:1载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：防止载体自连碱性磷酸单酯酶CIP、BAP2020/2/1622基因克隆操作过程CTGCA3'GG3'ACGTC5'GCATG3'C5'C3'GTACGGCATGCCCCCC3'CC3'CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG3'GG3'GGGGGGACGTC5'5'GCATGCCCCCCGCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGTdTdCTPTdTdGTP退火KlenowT4-DNAligase提高重组率的方法加装同聚尾末端2020/2/1623基因克隆操作过程二、重组DNA分子的转化和扩增——转与增2020/2/1624基因克隆操作过程1.转化的原理与技术（1）Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化原理：Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立。其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。处于感受态的细菌，容易接受外源DNA。2020/2/1625基因克隆操作过程2020/2/16基因克隆操作过程《分子克隆第三版》OD600=0.4左右26基因克隆操作过程2020/2/16《分子克隆第三版》27Ca2+诱导转化过程中应注意的事项转化所用DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%；热击过程中不要摇晃离心管；检测转化子的Amp抗性时，转化子铺平板时密度应低一些（104菌落/板）；转化子于37℃培养不要超过20小时。因为铺板过密或培养时间过久会导致平板上出现卫星菌落。转化过程中37℃温育菌体使细菌复苏时的转速不可过高，为得到较高的转化效率，应使转速小于225rpm。当用于涂板的转化液过多时，应离心浓缩（4100rpm，5min），并用适量SOC液体培养基重悬菌体沉淀后涂板。刚进行完转化的菌体比较脆弱，涂板时应轻轻涂布。2020/2/1628基因克隆操作过程提高转化效率的几个重要因素：细胞生长状态和密度不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。质粒的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的cccDNA可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。2020/2/1629基因克隆操作过程试剂的质量所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的，并用超纯水配制（过滤除菌，非高压灭菌），最好分装保存于干燥的冷暗处（冰箱4℃）。防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿如离心管、枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选和鉴定带来不必要的麻烦。2020/2/1630基因克隆操作过程（2）细菌原生质体的转化适用对象：革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等），其接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常去除细胞壁后再进行转化，这与酵母菌、霉菌、植物细胞等类似。细菌原生质体的制备：不同细菌的原生质体制备方法不尽相同。以链霉菌为例，细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水、无去污剂。细菌原生质体的转化：由PEG和Ca2+介导细菌原生质体的再生：原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素。2020/2/1631基因克隆操作过程（3）λ噬菌体DNA的转染感受态细胞的培养：将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600=0.5。吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟。转染裂解：加入20倍体积的新鲜培养基，30℃继续培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选。2020/2/1632基因克隆操作过程（4）电穿孔转化原理：将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。特点：电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。2020/2/1633基因克隆操作过程（5）酵母的转化一般有以下两种方法：利用酵母的原生质球进行转化利用Li+盐进行转化（6）植物细胞的转化及其他基因转移方法叶盘法电击法基因枪法（7）哺乳动物细