目的基因

Genedetection,cloningandtransformation目的基因•可克隆的优良性状的相关基因•主要是结构基因DNA克隆•DNAcloning•Subcloning•Hostandvector•DNAlibraries•Screeninglibraries•Analysisofclones•Applicationofclone结构基因组成•转录启动子、基因编码区、转录终止子。•启动子：DNA上RNA聚合酶识别、结合和促使转录的一段核苷酸序列。•转录起始位点：转录mRNA的第一个碱基，多数是A，以此作为序列的＋1，其上游核苷酸序列为“一”，下游核苷酸序列为“＋”。•基因编码区：包括起译码ATG、开读框和休止码TAA（TAG、TGA）。•终止子：提供转录停止信息的核苷酸序列。原核生物结构基因组成•多数以操纵子形式存在，同类功能的多个基因聚在一起，处于同一个启动子调控之下，下游同具一个终止子，但各基因分别有起译码ATG和休止码TAA（TAG、TGA）。•两个基因之间存在长度不等的间隔序列，但有例外。•启动子含－35序列保守区5’TTGACA3’，－10序列保守区5’TATAAT3’。•操纵子除启动子外，往往有一些调控转录的其他因子。•在起译码上游约10bp处，有一SD保守区，一般为AGGA。•转录终止之前常有一段回文序列结构－终止子。真核生物结构基因组成•基因单独存在，两个基因之间有很长的间隔序列区。内含子、外显子。•转录启动子有3个保守序列区：－20--－30：TATA框，DNA在此处开始解链；－70：CAAT框，RNA聚合酶结合。更上游：GC框，转录调控因子结合。•休止码下游有一保守的AATAAA提供转录产物的释放信号。•不具SD序列区，核糖体与转录的mRNA结合靠mRNA5’端添加的“帽”结构。分离目的基因•通过构建cDNA文库和基因组文库产生的cDNA只含编码序列，进行表达还须外加启动子、终止子等调控转录元件。由于mRNA在不同组织、不同发育时期的细胞内丰度不同，必须用高丰度的mRNA来构建cDNA文库。•用PCR技术Genecloning①DNAflagmentsa.chromosalDNAfromanimal,plantsandmicrobes；b.cDNAfrommRNAreversetranscriptedinvitroc.chemicalsynthersizedDNA②insertforeighDNAintoplasmid③transformation④selectionandidentification⑤expressionanalysis原核生物的人工转化对于体外连接的重组DNA分子，必须采取特殊的保护措施，否则在几小时内就会全部降解。因此在连接后，应尽快引入受体细胞。许多细菌不具有自然转化的能力，需要通过人工诱导才能出现感受态。competence自然界中不是所有细菌都能进行自然转化，也不是生长的任何阶段都具有吸收DNA的能力，把细菌能从周围环境中吸收DNA的生理状态称为感受态。感受态的出现是由于细菌表面出现许多DNA结合位点，这些位点只能与双链DNA结合，而不与单链DNA结合。这说明完整的双链结构对于转化活性来说是必要的；DNA的进入和整合均为单链状态。转化效率决定于三个内在因素:①受体细胞的感受态；②受体细胞的限制酶系统，它决定转化因子在整合前是否被分解；③受体和供体染色体的同源性，它决定转化因子的整合，因为转化因子总是与碱基顺序相同的或相近的受体DNA相配合，亲缘关系越近的其同源性也越强。当DNA与细胞在Ca2+和DMSO存在条件下混合，在水浴中反应20～40分钟以后进行45℃的热脉冲(heatshock)可增加DNA的吸收。大肠杆菌摄取DNA是非选择性的，而且可以用异源启动子启动转录和蛋白质合成，这使得大肠杆菌成为克隆实验的理想系统。CaCl2方法的转化效率一般可达106-107转化子/μgDNA。关键是(1)使用对数生长期的细菌；(2)低温操作。优点:简单、稳定、可重复性高。缺点:转化效率稍低，而且不能转化大质粒(＞15Kb)影响细菌转化频率:转化DNA的浓度、纯度和构型转化细胞的生理状态经CaCl2处理后的成活率转化环境：温度、pH、离子浓度MgCl2转化：Mg++对于维持DNA稳定性方面，可能起到重要的作用。克隆子的筛选•利用抗菌素抗性基因等标记抗性基因、X-gal和IPTG蓝白斑•双酶切片段重组法•报告基因（GUS、LUC、NPT-II、CAT）克隆子的鉴定•酶切•分子杂交：斑点、Southern杂交•PCR•DNA测序•转录产物检测•翻译产物检测PEG(polyethylemeglycol6000)适用：不能形成感受态的G+细菌用细胞壁降解酶完全除去肽葡聚糖层，使其维持在等渗培养基中，在PEG存在条件下，质粒或噬菌体DNA可高效地被导入原生质体。植物细胞转化•Ti转化法叶盘转化法、原生质体共培养法、悬浮细胞共培养法•直接转移法电穿孔、微弹轰击法、激光微束穿孔法、多聚物介导法、花粉管通道法、显微注射法、脂质体介导法。建立对植物有效转化基本要求：(1)转化系统不受基因型的限制；(2)易于获得大量的转基因植株；(3)尽可能缩短获得转基因植株的周期；(4)避免使用原生质体作为转基因受体。基因枪转化方法基本满足了上述要求。biolistictransformationParticlebombardmentBiolisticprocessHigh-velocitymicroprojectile原理：籍高速运动的金属微粒将附着于其表面的包裹有DNA的钨象子弹一样以高压射进细胞并使DNA留在细胞内，特别是留在细胞器中。typesofbiolisticandtansformationmechanism基因枪法：利用火药爆炸、高压放电或高压气体作为驱动力加速金属粒子(微弹)，使其进入带壁细胞的一种方法。质粒DNA首先沉淀在微弹(钨粉、金粉等)表面(通常以氯化钙、亚精胺作为沉淀剂来促进DNA与微弹的结合)，结合有DNA分子的微弹经加速而获得足够动量，进而穿透植物细胞壁进入靶细胞，随后释放出DNA分子并随机整合到寄主的基因组内。根据动力来源的不同，基因枪大体可以分为火药式、放电式和气动式三种类型。Electricdischarge工作原理：通过高压放电引起水滴气产生冲力，驱动微弹载体连同微弹加速运动。“气动式”和“放电式”都具有精确调节微弹速度的性能转化受体要求：凡具备再生能力的细胞或组织十分广泛：原生质体、悬浮细胞、根茎切段、叶圆片、成熟胚、幼胚、分生组织、愈伤组织、花粉细胞和胚芽鞘等选择适当的转化受体材料：十分关键。最常用有细胞悬浮系、愈伤组织、幼胚、成熟胚和茎尖分生组织。影响基因枪转化频率的因素理化因素：基因枪的一些轰击参数，包括微弹的速度、挡板与靶细胞间的距离(射程)、弹膛内的真空度、轰击次数、DNA的纯度与浓度、微弹的类型、大小及用量以及DNA沉淀剂(氯化钙与亚精胺)的浓度等。生理因素：轰击前后的培养条件不同生理状态的植物材料接受外源DNA的能力是不同的动物细胞转化•病毒颗粒转导法•磷酸钙转染法•DEAE-葡聚糖转染法•DMSO（二甲基亚砜）转染法•脂质体介导法•显微注射•基因打靶•电穿孔transformationformamalialanimalsa.磷酸钙沉淀法:Ca2+促进哺乳动物细胞吸收外源DNAb.共转化：将过量的媒介DNA与带有tk基因的重组DNA混合，用Ca2+沉淀转化细胞。c.微量注射：一台仪器每小时注射500-1000个细胞，约50%的细胞能稳定地整合并表达，任何DNA都可注射到任何细胞中，效率高，不需筛选压力，但需要昂贵的仪器，技术复杂，难以掌握。electroporation许多细菌和真核系统，无感受态操作方便、基因转移效率高，适用真核生物和原核生物方法：用高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔，使各种大分子(包括DNA)通过这些小孔进入细胞。大肠杆菌中，优化参数（电场强度、电脉冲长度、DNA的浓度），每微克DNA可得到109-1010转化体主要影响因素:脉冲最大电压：电压太小，转化效率低；电压太大，细胞不能成活。脉冲持续时间线性化DNA有较高的重组机率；一般电击前后将细胞置冰浴10min调节电场强度和脉冲长度使50-75％细菌死亡，可得到最高转化效率。最高转化率可达109-1010转化子/μgDNA。转化率每毫克转化的质粒DNA所产生的具抗生素抗性的克隆数转化子的增殖与保存单克隆，接种含选择标记抗生素的液体培养基中，部分菌液冻存于甘油保存液中。克隆技术的应用•重组蛋白•GMO•DNA指纹分析•医学诊断•基因治疗