DNA的粗提取和鉴定

DNA的粗提取和鉴定目的要求•1、了解从细胞中提取DNA的基本原理•2、初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法•3、观察提取出来的DNA实验思路•1、DNA从哪提取？•2、怎样将DNA与细胞中的其他物质分离？•3、怎样鉴定我们提取的DNA？实验原理•1.DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂实验用具：铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（100ml，一个）；烧杯；（100ml，一个，50ml、500ml各二个）；试管（20ml，二个）；漏斗；试管夹；纱布。二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计（一）实验材料的选取材料：新鲜的鸡血注意：本实验中，要往鸡血中加入抗凝剂（柠檬酸钠溶液）原则上只要含DNA的生物材料都可以，但是选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。(1)先将新鲜的鸡血离心，获得鸡血细胞(2)在鸡血细胞中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液1、破碎细胞讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？利用了什么原理？2、过滤，获取含DNA的滤液（三）去除滤液中的杂质为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？答：可能含有核蛋白和RNA等杂质讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质（四）DNA的析出与鉴定DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95％），静置2-3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水1、DNA的析出2、DNA的鉴定鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色（一）案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取三、实验案例②用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长1、鸡血细胞做实验材料的原因①鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得4、课前准备鸡血细胞液取质量浓度为0．1g/ml的柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min（转每分）的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）①过程②柠檬酸钠作用防止血液凝固③作用机理柠檬酸钠能与血浆中的Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液就不会凝固鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液④注意事项讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆5、方法步骤将制备好的鸡血细胞液5mL～10mL，注入到50mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒充分搅拌5min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。①提取鸡血细胞的细胞核物质讨论：答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破（1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？（2）用玻璃棒搅拌有什么意义？答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA（3）滤去的是什么物质？得到的是什么？答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA②溶解细胞核内的DNA将氯化钠的物质的量浓度为2mol的溶40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14mol／L）③析出含DNA的粘稠物讨论：加入蒸馏水的目的？降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕注意事项：④滤取含DNA的粘稠物用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中，含DNA的粘稠物被留在纱布上⑤将DNA的粘稠物再溶解取1个50mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2mol／L的溶液20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中⑥过滤含有DNA的氯化钠溶液取1个100mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中⑦提取含杂质较少的DNA在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为95％的溶液50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中讨论：（2）观察丝状物呈什么颜色？答：白色（1）为什么要加50mL的冷酒精？取两支20mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0．015mol／L的溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化⑧DNA的鉴定答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌”6、讨论：①两次蒸馏水第一次：细胞吸水胀破第一步第二次：使DNA黏稠物析出第三步（1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为1－2层②三次过滤第一次：DNA存在于滤液里第一步第二次：DNA被留在纱布上第四步第三次：DNA存在于滤液里第六步③两次析出第一次：用0.14mol／L的NaCI溶液含杂质多第三步第二次：用冷却的95％的酒精第七步④六次搅拌：第一、二、三、五、七步其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离方案二利用了酶的专一性；方案三利用了DNA的稳定性。5分鐘內做出自己的DNA•材料：萃取出DNA的材料（人）含有SDS的清潔劑（幾乎大部分都有）食鹽水嫩精（木瓜酵素papain）筷子吸管透明杯子95%酒精5分鐘內做出自己的DNA•方法：1.95%酒精放在冰箱備用。2.緩衝液：120ml的水+1又1/4茶匙的鹽+一點點洗髮精+一點點嫩精，輕輕攪拌後放在冰箱備用。3.準備萃取DNA的材料：取10ml的水漱口1分鐘，吐在杯子裡，加入20ml的緩衝液，以筷子輕輕攪拌2分鐘。4.用吸管吸取95%的酒精從杯壁慢慢加入杯中。酒精會浮在上層，接著就會出現絲狀物，那就是你的DNA。準備小罐子裡頭加上70%的酒精，再把DNA放進去，你就會擁有特別的禮物囉！拿自己的DNA送人，不錯喔！(情人節送雙套，不要送單套）