第五章 中药指纹图谱

第五章中药指纹图谱与特征图谱大纲要求★掌握中药指纹图谱分析及评价▲熟悉中药指纹图谱研究程序及技术要求●了解中药指纹图谱测定方法同一个成药，疗效一致么？•不同厂家：•不同工艺：•不同辅料：ForsythiasideAForsythin123ⅠⅡⅢ青翘ImmatureLianqiao老翘matureLianqiao老翘（无种子）MatureLianqiao（withoutseeds)质量相差悬殊的‘连翘’药材Greatdisparityofingredientsindifferent‘Lianqiao’crudedrugs•青翘→老翘→无籽老翘所含有效成分递减相同处方，不同工艺，疗效？2020/2/167min01020304050mAU02004006008001000120014001600DAD1B,Sig=254,16Ref=360,100(SQ\012-0201.D)cmin01020304050mAU020040060080010001200DAD1B,Sig=254,16Ref=360,100(SQ\013-0301.D)cmin01020304050mAU0100200300400500600700DAD1B,Sig=254,16Ref=360,100(SQ\XD010901.D)cmin01020304050mAU0100200300400500600700DAD1B,Sig=254,16Ref=360,100(SQ\011-0101.D)c目前中药质量控制的局限齐墩果酸、熊果酸、大黄酸、槲皮素、小檗碱●缺乏化学对照品●化学对照品缺乏专属性●物质群体间的量化特征无法体现黄柏、黄连——小檗碱、巴马亭的比例人参、西洋参或三七——几种人参皂苷的比例●中药整体的用药的特色无法体现第一节概述中药色谱指纹图谱的提出中药依赖其所含的多种化学成份发挥疗效任何单一的活性成份或指标成份都难以有效地评价中药的真伪优劣利用现代分析技术分析不同中（成）药的整体特征以提高鉴别的准确性——指纹图谱分析（ChromatographicFingerprintAnalysis）第一节概述定义:中药指纹图谱是指中药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药特性的共有峰的图谱，是一种新的中药质量控制模式。中药指纹图谱的基本属性：整体性和模糊性。整体性：强调多个成分（共有指纹峰）的相对稳定的比例、排列顺序及相互的牵制，反映的质量信息是综合的。模糊性：中药化学成分复杂性+次生代谢产物化学成分不确定性，具有无法精密度量的模糊性。中药特征图谱的提出定义:中药特征图谱是指中药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其中各种组分群特征的共有峰的图谱，是一种新的中药质量控制模式。中药指纹图谱和中药特征图谱均以表征中药内在质量的整体变化为评价目的图谱分析：强调准确的辨认，而不是精密的计算。图谱比较：强调的是相似性，而不是相同。特点：(1)通过指纹图谱或特征图谱的特征性，能有效鉴别中药的真伪。(2)通过指纹图谱或特征图谱主要特征峰的面积和比例的制定，能有效控制中药质量，保证中药质量的相对稳定（即稳定性和均一性）。指纹图谱的作用对中药质量标准的补充和提高。控制原料、中间体、成品的一致性，控制工艺，减少批间差异。指纹图谱的特性稳定性（重现性）在规定的方法与条件下，不同的操作者和不同的实验室应能重复能反映中药有效部位所含大部分成分的种类，或指标成分的全部能特征地区分中药的真伪与优劣指纹图谱中应包含的信息•中药材和中药饮片：•种的共性•产地、采收期、炮制方法的个性信息。•半成品和中药制剂：•原药材（甚至辅料）的信息•工艺信息等。•药效信息(二)指纹图谱的发展现状1.指纹图谱的发展阶段：初级阶段:是确立指纹图谱的建立方法及相似度判定。研究重点主要是测定方法的建立，方法稳定性和适用性考察，化学有效部分基础研究，图谱多指标控制等，力求基本说清中药化学基础及质量控制参数，将中药质量控制提到整体量化的高度。高级阶段:即指纹图谱特征和药效相关性研究，指纹图谱的生物等效性研究。中药指纹图谱的研究向多学科的相互渗透、从单指标向多指标（多维多息）的综合发展，最终建立体现谱效关系的指纹图谱，确保中药安全、有效和可控。2.指纹图谱的分类指纹图谱可按应用对象、测定手段进行不同的分类。⑴按应用对象分类：①中药材(原料药材)指纹图谱②中药原料药(包括饮片、配伍颗粒)指纹图谱③中药中间体（工艺生产过程中间产物）指纹图谱④中药制剂指纹图谱按测定方法分类:①中药化学指纹图谱指纹图谱系指采用色谱、光谱和其他分析方法建立的用以表征中药化学成分的特征的指纹图谱。中药化学指纹图谱对控制中药质量具有更直接、更重要的意义。色谱指纹图谱：TLC、GC、GC-MS、HPLC、HPLC-MS等光谱指纹图谱：UV、IR、FP、NMR、MS等②中药生物指纹图谱包括：中药材DNA指纹图谱中药基因组学指纹图谱中药蛋白组学指纹图谱中药材DNA指纹图谱主要是测定各种中药材的DNA图谱，由于每个物种基因的唯一性和遗传性，中药材DNA指纹图谱可用于对中药材的种属鉴定、植物分类研究和品质研究。它对中药材GAP基地建设、中药材种植规范(SOP)、选择优良种质资源和药材道地性研究极为有用。中药基因组学图谱和中药蛋白组学指纹图谱系指用中药作用于某特定细胞或动物后，引起的基因和蛋白的复杂的变化情况，这两种指纹图谱可称为生物活性指纹图谱。中药蛋白组学指纹图谱是指纹图谱研究的最高级阶段，可确定中药的主要活性物质。第二节中药指纹图谱研究程序及技术要求（一）指纹图谱的要求中药指纹图谱应满足特征性、重现性和可操作性的技术要求（即三性要求）。当一张指纹图谱不足以表现其全部特征，可用几张指纹图谱来表现某种中药(药材或复方)的各个不同侧面的特征，从而构成其全貌。对每一张图谱都应有其特征性。丹参滴丸多元HPLC指纹图谱min5101520253035mAU050100150200250300*DAD1,Sig=280.00,2.00Ref=off,EXTofD03070~1.D12345678910min10203040506070mAU-500501001502001234685791012141651718111315(A)(B)指纹图谱I(280nm)指纹图谱II(203nm)首先具备专属性或唯一性。能够表达某品种特征的性质。在满足专属性前提下要有较好的重现性，指同一品种的同一样品，同一操作条件下，结果的重现性要好，即不同实验室和不同操作者得到的色谱整体特征应有较高的相似度(0.9以上)。具有可操作性。指针对不同用途，选用不同分析方法来达到不同的要求，选择的方法和试验条件应便于推广和便于操作，要有普遍适用性。（二）指纹图谱的构建方法1、色谱法色谱技术具有极强的分离能力和极大的适应性，中药指纹图谱首推色谱法，其常用的方法有：TLC、GC、HPLC、HPCE、SFC等。薄层色谱ThinLayerChromatography(TLC)●可在同板同时分析多达18个样品，时效高●所用的是正相展开剂，其组成变化灵活，可适应多种成分的分离●既可直观比较图谱，又可扫描得到轮廓图和处理数据●具有色彩参数，可获得色彩丰富的色谱图像，直观性强；同时辅以功能团显色剂还可提示成分的类别，提高鉴别的专属性。●离线操作，占机时间短●展距局限10cm~20cm，‘柱效’相对较低，对复杂组分不提高分离度则难以提取指纹特征的药材受到限制。●开放系统，对环境温度、相对湿度要求较高反相高效液相色谱法ReversedPhaseHighPerformanceLiquidChromatography●适用范围广●分离性能好●分析速度快●流动相选择范围宽●灵敏度高●色谱柱可多次重复使用●流出组分可以收集●采用多种检测器，可同时获取保留值信息和化合物的光谱、质谱信息对较为复杂的色谱实验条件要求比较苛刻，由此带来不同实验室之间重现性的难度增大诃子指纹图谱诃子小诃子大诃子绒毛诃子气相色谱GasChromatography(GC)●分离效能高●分析速度快●适用于植物的挥发油成分及其它易挥发性成分或可转化为可挥发的成分测定●可提供保留值信息，与质谱联用，还可提供更丰富的化学结构信息分辨率高，得到的色谱组份非常复杂，尤其是含挥发油药材，单萜类成分组成很不稳定，样品间差异可能很大，处理数据和判别相似度时一定程度的取舍毛细管电泳CapillaryElectrophoresis●分离效能高●分析速度快●高分辨率●可与紫外、荧光、电化学、质谱、拉曼光谱等联用，可提供更丰富的化学结构信息肉桂油的气相色谱指纹图谱HPCE指纹图谱红外光谱InfraredSpectra●几乎所有的物质都有特征的红外光谱。●虽然植物中药提取物还是一个混合物，但是由于不同物质的红外光谱具有加合性，因此，植物中药提取物的红外光谱能反映出所有成分的综合信息因而具有全息光谱的特点。操作简便（不需要复杂的提取仪器）、快速、准确、经济、溶剂低毒、重复性高、实用性强。•中国药典规定：小蓟在开花时采。•根据1384cm-1处吸收峰的有无，可以鉴别其采集时间是否正确。小蓟丁酮提取物的红外指纹图谱中药指纹图谱供试品溶液10批以上中药图谱信息固定产地、采收期和加工炮制的中药中药未知检品预处理不同产地、采收期和加工炮制的中药评价标准药效学试验代表性均一性选择测试条件方法建立考察测定图谱参数图谱分析相关性图谱评价图谱测试、相似度评价方法检验中药指纹图谱的研究程序一、研究方案设计1、研究对象的确定君药、臣药中有效成分作为主要研究对象2、研究内容⑴样品收集：要求有一定的数量，以保证供试品的代表性和均一性⑵溶液的制备：包括对照品溶液和供试品溶液的制备。⑶检测方法确立：包括测定方法、供试品溶液制备的提取条件、测定条件等筛选。⑷方法学考察试验：包括精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及图谱采集记录时间的考察试验。⑸标准制定：根据多批次样品测定图谱，建立共有模式，制定评价指标等。二、样品收集样品收集是研究指纹图谱最初也是最关键的步骤，收集的样品要有足够的代表性。要求收集10批次以上的样品。样品数越多越好，使得到的指纹图谱更具生物统计学意义。最关键的步骤真实性代表性10批以上原药材：不同产地、不同采收季节等样品收集原则：1）正品优质道地药材，或规范化种植药材。2）结合临床使用情况选择性收集药材样品。3）不同产地、不同采收期药材样品（指导实际合理“勾兑”过程）。4）中间体、中药制剂的样品收集，应选择工艺稳定、疗效恒定、临床使用中很少异常的批次。注意：收集药材样品“批次”，其含义与工业产品“批次”的含义是完全不同的，它是指相互独立的样品，即不能将同一地点或同一渠道同一时间获得的样品分成若干批次样品。不同产地或同一产地不同等级规格的样品，均可视作不同批次。同一产地的样品，存在不同的种植园和地块之差异，也均可视作不同批次。三、供试品溶液的制备根据中药中所含化学成分的理化性质和检测方法的要求，选择适宜的制备方法。制备方法必须确保中药中的主要化学成分或有效成分在指纹图谱中得以体现。•原药材、饮片供试品溶液的制备尽可能与生产工艺的提取溶剂接近或一致，定量操作•半成品/中间体供试品溶液的制备参考制剂和产品制备工艺•中药制剂供试品溶液的制备直接使用、稀释或溶剂提取的方式四、对照品(参照物)溶液制备建立指纹图谱应设立参照物或参照峰。对照品作为参照物：常为供试品中主要成分或者峰面积相对较大、较稳定的共有峰（内参物）制备：根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行。五、研究方法的选择包括指纹图谱试验方法和试验条件的优选，是通过比较试验，从中选取相对简单易行的方法和条件，获取足以代表品种特征的指纹图谱，以满足指纹图谱的专属性、重现性和可操作性的要求，并须经过方法学验证。首选色谱方法，其中HPLC法适用范围广，对含生物碱、蒽醌、黄酮、有机酸、酚类、木脂素等成分的中药均可采用。(一)测定条件的选择提取条件、色谱条件需进行优化，在定量操作的前提下，使供试品中所含成分