克隆性分析的临床应用 - 副本

北京海思特临床检验所有限公司2017-07-20内容MDS与克隆性染色体异常与MDS的克隆性基因突变与MDS的克隆性基因芯片与基因突变的联合应用1MDS疾病的概述是起源于造血干细胞的一组异质性髓系克隆性疾病，特点是髓系细胞发育异常，表现为无效造血、难治性血细胞减少，高风险向急性髓系白血病（AML）转化。核出芽核碎裂核间桥特点骨髓增生异常综合征分类——WHO2016版关键词：病态造血单系或多系环形铁粒幼细胞病态造血MDS的病态造血细胞主要来自于恶性克隆。病态造血可以反映MDS的本质，但不是MDS所特有疾病诊断的根本，证明病态造血是MDS克隆所致MDS是不明原因导致的癌性造血克隆逐渐扩增，引起的正常造血衰竭性疾病。癌性克隆出现癌性克隆获增殖优势癌性细胞↑正常血细胞↓dysplasiapancytopeniaHb↓WBC↓PLT↓normalMDSAML正常2MDS疾病的本质染色体与克隆性至少2个细胞有同样的染色体增加或结构重排，或者至少3个细胞有同样的染色体丢失，方可确认存在1个异常克隆。————《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN1995）》血液肿瘤患者的染色体畸变常呈克隆性，此种克隆性明确提示疾病的恶性本质。3MDS的单克隆细胞群的标记NEnglJMed2012;366:1090-8.基因突变的积累会导致正常细胞获得恶性克隆。从MDS阶段到sAML阶段分子克隆是一个演化的过程。（分子克隆的种类逐渐增加，各克隆的所占比例也发生较大变化。）基因突变与克隆性4MDS的单克隆性分析的重要性维也纳诊断标准中明确提出染色体、基因突变克隆性分析的重要性内容MDS与克隆性染色体异常与MDS的克隆性基因突变与MDS的克隆性基因芯片与基因突变的联合应用1MDS患者的染色体异常40-60%MDS患者具有非随机的染色体异常。MDS中染色体异常及比例（WH02008）2染色体的诊断价值难治性血细胞减少，遗传学异常与MDS特异性较高的染色体核型包括:-7/7q-、-5/5q-、-13/13q-、11q-、12p-/t(12p)及平衡性易位如t(11;16)、t(3;21)、t(1;3)、t(2;11)等。del(20q)、+8、-Y当形态学证据不充足时可以诊断为MDS不能推测为MDS当形态学证据不充足时3染色体的预后价值染色体核型分析至少20个骨髓细胞的中期分裂象，阳性检出率低骨髓增生异常综合征中国专家共识（2014版）4染色体检测手段的要求FISH对染色体检测阳性率可以达到50%，但是探针数量有限。骨髓增生异常综合征中国专家共识（2014版）FISH检测基因芯片技术骨髓增生异常综合征中国专家共识（2014版）单亲二倍体：是指一对同源染色体全部来自父亲或母亲。UPD分为遗传性和获得性两种，获得性UPD在癌症的发展过程起重要的作用。20%的MDS患者表现为获得性UPD，获得性UPD可导致受累基因的纯合突变，在MDS患者中通常表现为MDS相关基因的纯合突变。5全基因组芯片原理MillionsoflocationsavailableoneachGeneChiparrayTheprobesareallbetween25and49bpinlengthMicroarray:探针包埋在固相支撑物上提供丰富的生物信息寡核苷酸探针客服了分辨率的局限:TheDNAprobes在25-80bp长度间在1.28×1.28cm上能够包含650w个生物探针在检测CNV方面数据质量极高可以发展成为能够检测非CNV的突变,e.g.LOH,UPDandIBD区域.可以用于genotyping基因芯片可检测染色体扩增/缺失/单亲二倍体芯片检测结果提示基因芯片在临床应用的意义•基因芯片可提高染色体异常检出率。MDS染色体异常的阳性检出率为78%，其中20%阳性异常为UPD；而染色体核型+FISH的检出率为59%。Blood-2011-Tiu-4552-60•不同的预后分组的MDS患者结合基因芯片结果后，OS存在较大差异芯片临床应用时机MDS的诊断与鉴别诊断•特异性诊断价值的克隆性证据寻找（如-7/7q-、-5/5q-、-13/13q-、11q-等。）以辅助MDS的诊断。•与其他非克隆性疾病的鉴别诊断（AA、IRP等）MDS的预后判断•对染色体异常的全面检出，更能契合IPSS-R预后系统的分层评估。作为细胞遗传学的补充手段，提高染色体异常检出率。（单亲二倍体、缺失、扩增更高的检出率）内容MDS与克隆性染色体异常与MDS的克隆性基因突变与MDS的克隆性基因芯片与基因突变的联合应用1987年首次报道MDS患者存在基因突变基因突变里程碑式的进展2011年报道：核型正常的MDS患者，近50%存在基因突变2014年：MDS中国版专家共识将常见的几种基因突变纳入其中基因突变克隆性分析的关键确定基因突变的致病性，是克隆造血的关键证据！MDS相关基因突变检测突变位点无临床意义有临床意义多态性非多态性胚系突变获得性突变会导致克隆性造血的点突变确定胚系突变的临床意义：患者病因确定，调整治疗方案。造血干细胞移植供者筛查。患者的遗传咨询，及定期随访。单核苷酸多态性（SNP）与非多态性位点突变的鉴别SNP指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。胚系突变与获得性突变的鉴别胚系突变：基因突变通过卵子和/精子传递，导致几乎所有的胚胎细胞都存在相同的突变，这种突变可以代代相传。获得性突变：后天由于某种原因导致的体细胞发生的突变。几个概念，助于理解何为致病性基因突变克隆性分析的临床应用1提示克隆性造血的存在，为诊断提供参考依据。2017版NCCN指南明确提出：基因突变，可提示MDS的克隆性造血的存在。对于无法确诊的MDS患者，基因突变的克隆性分析，可以提供辅助标准指标。2辅助疾病亚类的鉴别MDS伴单系病态造血MDS伴多系病态造血MDS伴环形铁粒幼细胞SF3B1基因突变，可作为MDS疾病亚型的分类。3.1SF3B1基因SF3B1基因定位于2q33，是RNA剪切因子常见的剪切因子有SF3B1、SRSF2、U2AF1、ZRSR2、等，这类基因的突变存在互相排斥性，即在同一例患者中几乎只出现其中1个基因突变Yoshidaetal.,Nature,20113.2SF3B1与环形铁粒幼细胞的相关性Blood，2013（121）：260-269血红素合成的基因表达异常线粒体铁代谢异常•在MDS或MDS/MPN患者中，存在SF3B1基因突变时，出现伴有环形铁粒幼细胞的可能性为97.7%，而SF3B1基因不突变时，97.8%的可能性不会出现环形铁粒幼细胞。3.1SF3B1基因突变MDS-RSRARSRuiCui,etal.LeukemiaResearch.2012,36:1428若存在SF3B1基因突变，提示预后较好。3辅助疾病的预后判断RafaelBejar.haematologica2014;99(6)在IPSS-R预后分级为极低危、低危、中危的患者，若存在TP53,EZH2,ETV6,RUNX1,ASXL1突变中的任何一种，预后较差。3.2影响危险分级—TP53,EZH2,ETV6,RUNX1,ASXL1携带的基因突变数量和种类越多，疾病的预后分层越差，进展越快，转化为AML的几率越高。3.3基因突变数量影响预后Haematologica.2014Jun;99(6):956-964.MDS的病人同时存在许多表观遗传控制基因的突变,如ASXL1、DNMT3A、EZH2、IDH1、IDH2和TET2等。通过对这些基因突变的检测可进一步预测MDS是否会对去甲基化药物发生反应。4临床指导用药4.1去甲基化药物敏感性预测骨髓增生异常综合征诊断与治疗专家共识（2012版）4.2TP53与来那度胺诊断与鉴别诊断预后判断用药指导环状铁粒幼细胞与SF3B1MDS基因突变分析套餐IPSS-R+MDS基因突变分析套餐去甲基化药物：ASXL1、DNMT3A、EZH2、IDH1、IDH2和TET2来那度胺治疗：TP53基因突变免疫制剂治疗（ATG、环孢素）：HLA-DR15基因检测基因突变小结5临床应用小结内容MDS与克隆性染色体异常与MDS的克隆性基因突变与MDS的克隆性基因芯片与基因突变的联合应用联合二者综合分析基因突变基因芯片某些基因位点突变分析染色体的高分辨分析，可检出染色体扩增、缺失、单亲二倍体/杂合性缺失二个方法联合，可全面捕获MDS克隆证据，提高检出率。备注：MDS需多指标综合诊断，此种联合也必须建立在骨髓细胞学、骨髓活检、常规染色体分析等方面检测的基础之上。对61例MDS/CMML患者联合评估材料和方法•韩国8个医院收集经WHO分类的61位MDS/CMML患者，将地西他滨用于一线治疗方案。染色体核型分析IPSS分组治疗前基因芯片检测临床跟踪分析患者信息•基因芯片检出结果联合EZH2、TP53基因突变对OS、EFS的影响。1MDS克隆性基因突变套餐（20种）目的：寻找MDS病态造血的克隆性证据，辅助疾病亚型分类及预后判断。适用人群：疑似MDS患者指标权威参考：覆盖WHO指南、NCCN指南所提到的基因突变指标覆盖深度：检出率大于10%——TET2、DNMT3A、ASXL1、SF3B1、SRSF2、U2AF1、TP53、RUNX1检出率在5-10%——EZH2、ZRSR2、STAG2、NRAS检出率在2-5%——BCOR、SETBP1、IDH1、IDH2、ETV6、JAK2、CBL、KRASMDS相关基因突变检测突变位点无临床意义有临床意义多态性非多态性胚系突变获得性突变胚系与获得性鉴别：髓系肿瘤中常见的胚系突变（RUNX1、ETV6等）可导致克隆性造血已明确的获得性突变导致MDS的克隆性造血2髓系肿瘤高频基因突变（30种）目的：AML、MDS、MPN/MDS等疾病的高频基因突变检测适用人群：疑似MDS患者、AML患者覆盖广度：MDS检出率大于10%——TET2、DNMT3A、ASXL1、SF3B1、SRSF2、U2AF1、TP53、RUNX1AML检出率在10%——IDH1、IDH2、FLT3/ITD、NPM1、KIT、CEBPA、DNMT3A、NRAS、WT1JMML相关基因：KRAS、NRAS、CBL、PTPN11、NF1、SETBP1CMML相关基因：TET2、SRSF2、ASXL1其他——BCOR、BCORL1、STAG2、PIGA、PHF6、JAK2、EZH2、ETV6、ZRSR23送检标本要求项目标本要求MDS克隆性基因突变套餐（20种）同时采集检测样本和验证样本检测样本：骨髓3-5mL,EDTA抗凝验证样本：口腔黏膜、头发、指甲髓系肿瘤高频基因突变（30种）骨髓3-5mL,EDTA抗凝（1）口腔黏膜：采样前30分钟内禁止吃东西、喝水或任何饮料。采样时，用力刮取两侧脸颊内口腔黏膜，左右脸颊都要刮，每侧10次，共刮取3-4根棉签），棉签在空气中自然晾干2h后，保存于EP管或无菌管中，4℃保存，72h送检。（2）头发：清洗头发后，2小时内取头发5-6根（要求带有明显的毛囊组织），保存于EP管中，4℃保存，72h送检。（3）指甲：指甲清洗干净后，取5-10mm长，1-2mm宽的指甲块，3-4块，常温保存于EP管中送检。Thanksforyourattention!