6 7 色谱聚焦 亲和色谱8

第六章色谱(层析）聚焦Chromatofocusing第一节概述据生物分子pI的不同，在动相中动速不同进行分离（适于水溶性的两性分子）特点：⑴.自动形成pH梯度，不需特殊实验装置；⑵.蛋白质聚焦自身pI范围，有浓缩效应，峰宽达0.04-0.05pH单位，分辨率很高。第三节PB与PBE一、PB（polybuffer）-多组分缓冲液为分子量不同的多羧基多氨基化合物（两性电解质性缓冲剂）特点：⑴.I不高，但缓冲力强；⑵.缓冲能力是均匀的。二、PBE(polybufferexchange)——多缓冲交换剂以交联琼脂糖SepharoseCL-6B为基质，并在糖上通过醚键偶合上配基而成如低聚乙烯亚胺要求：确保很宽的pH范围有均衡的缓冲容量。第四节实验要点步骤样品pI的查阅或测定选PBE，PB和起始缓冲液装柱，平衡安装仪器（增pH计）加PB少量入柱加样加PB洗脱再生PBE洗脱液脱PB一、PBE，PB和起始缓冲液的选择⑴.查pI或测定⑵.由pI确定pH梯度范围最大范围3～3.5为提高Rs,选择的pH范围应含要分离样品pI，并使其有2/3～1/2的柱长的吸附解吸时间。㈢.由产品性能表选择⑴.PBE94⑵.选始缓冲液pH9.4，乙醇胺-HAC（0.025）⑶.选PB96用HCl调pH7.0二、装柱㈠.PBE量由样品量确定PBE量一般100mgpr/10ml床体积、每pH单位㈡.柱选择H/D=30～60㈢.充填（同前）㈣.平衡用始缓平衡，要求：⑴.缓冲液使用前应先脱气，以除去其中CO2⑵.需平衡到进出液pH、I、电导都一样。㈤.校验柱装好坏，用有色的牛细胞色素C检查。三、样品㈠.VS因聚焦浓缩效应，VS最大可达50%～2Vt但最好≤0.5Vt㈡.I＜0.05㈢.加样要求：⑴.上样前应先加5mlPB，以免……⑵.需使样品均匀平整加在床面上四、洗脱㈠.洗脱剂用量pH取决于洗脱剂浓度梯度浓度大，峰间距小范围浓度小，峰宽大…梯度体积一般：12～13Vt㈡.流速一般线速在30～40cm/hr㈢.检测主要是目的物浓度、pH五、PB的除去1.沉淀法：加硫铵，再透析2.凝胶过滤：常用SephadexG-75六、再生一般：①.先除去吸附的杂质对pI＜6，在柱顶，可用1mol/LNaCl对pI很小，可用0.1mol/LHCl②.用起始缓冲液平衡七、保存24%乙醇八、结果讨论㈠.顶替（取代）效应带电量除与pI有关，还与滴定曲线有关，B在pH更高才被吸附（如下图所示）静电荷+-ABpHpH洗脱VIIpH后期I的增加出现竞争性结合影响B类分子的吸附造成B类分子提前洗脱㈡.陶南效应（阴IE）因表观pI下降，出现滞后洗脱。㈢.溶解度造成滞后洗脱因pHpI时S，往往需更低pH时，其S，才被洗出。第五节技术的应用1.蛋白质类（包括酶）的分离2.蛋白质类（包括酶）等电点测定P175-177第七章亲和色谱AffinityChromatography,AC第一节概述原理利用生物体中许多高分子化合物具有和某些相对应的分子可逆结合的特性建立的色谱法。一、特点高效、高收率、有浓缩效应，使用局限性二、应用高效从复杂混合物中得某一种物质；基于生物功能可把有活性与无活性分开三、基本过程须找配基（它与底物专一可逆结合如下图）亲和层析法的作用原理示意说明：1.偶联用Gel（须是活化偶联介质）2.亲和吸附剂高度专一亲和吸附剂类专一亲和吸附剂3.按相互作用力划分：次级键——亲和色谱配位键——螯合色谱共价键——共价色谱疏水键——疏水色谱亲和层析的必要条件:合适的配体（配基、ligand)合适的载体（Matrix)合适的吸附和洗脱条件第二节亲和色谱配基(ligandL)㈠作为配体的条件亲和力大;具有解离平衡;与载体偶联不失活㈡常用系统酶:底物或类似物、辅助因子、可逆抑制剂、效应物核酸:互补顺序、组蛋白、结合蛋白、核酸多聚物激素:受体、运载蛋白抗体:抗原、病毒、细胞外源凝集素:多糖、糖蛋白、细胞㈢配体的浓度一般使用较高的固定化配体浓度配体亲和力高，且本身带电则浓度须降低配体浓度过高引起色谱畸变。(与很多物质发生非特异性结合)㈣配体的选择1.考虑亲和势L+SLSKl=[L][S]/[LS]要求Kl在10-4～10-8mol/L之间2.与L的偶联不破坏L与S的结合3.需了解L-S的作用机制如……例：酶有单底物反应、双底物反应单APEEEAEP底物A、产物P或它们的类似物都可以双底物依次ABPQEEEAEABEPQEQ须选择A、若选B则吸附时须加A双底物随机A（B）B（A）P（Q）Q（P）EEEAEA（B）EPQA、B都可选择对A、B的选择仅取决于它们亲和势的大小和固定化的难易程度。第三节亲和层析载体一、作为载体的条件1.亲水2.惰性3.具有活化基团4.大网孔5.机械性能好二、载体的选择1.琼脂糖凝胶：亲水性强，理化性质稳定（商品名：Sepharose）2.聚丙烯酰胺凝胶：理化性质稳定，耐有机溶剂及去污剂，抗微生物能力强，特别适应用配基与提取物亲和力比较弱的物质。3.葡聚糖凝胶：有良好的化学及物理性质，孔径小。4.纤维素：非特异吸附严重，廉价，易得。5.多孔玻璃：物理性能好，有非特异性吸附。三、手臂（Spacerarm）在载体和配基间引入适当长度的“手臂”，减少载体的空间阻碍，增加配基的活动度。示意图如下：连接臂往往为烃链的疏水性手臂（其长短对吸附的影响大*）或具氨基、羧基的亲水性手臂（其长短对吸附的影响不大）疏水性手臂具体选择应考虑：⑴分离物质分子量大小⑵亲和势大小⑶过长手臂易弯曲、折叠等最常用的连接臂有6-氨基己酸、1,6-己二胺和3,3’-二氨基二丙胺。表7.3接有连接臂的亲和层析用载体载体连接臂供应商琼脂糖3-氨基丙基和琥珀酰氨基丙基Bio-Rad3,3’-二氨基丙基和琥珀酰二氨基丙基Bio-Rad1,2-二氨基乙烷,1-二氨基己烷,3,3’-二氨基二丙胺ICN1,6-己二胺,6-氨基己酸Pharmacia3,3’-二氨基丙基胺,对苯甲酰基-3,3’-二氨基丙基胺Serva氨基烷基(2,4,6,8,10)Miles聚丙烯酰胺-琼脂糖1,6-己二胺,6-氨基己酸IBF多孔玻璃氨基丙基,氨基己基Merck四、偶联用Gel㈠.CNBr活化型Sepharose溴化氰对多糖类载体的活化反应溴化氰活化多糖的配体偶联反应溴化氰法的特点：活化效率高，速度快，配体结合量大，毒性大。（废液可用碱性硫酸亚铁中和）主要影响因素：活化：CNBr的用量，pH，温度，时间偶联：配体的用量，pH，温度，时间，封闭㈡环氧活化型Sepharose环氧氯丙烷法的特点：活化效率低，速度慢，重复性较差毒性低，可引入亲水手臂，易操作㈢氨基琼脂糖㈣羧基琼脂糖五、类专一性亲和吸附剂㈠.固定化凝集素（本质是蛋白质）可用来分离糖、糖蛋白如……㈡.固定化多聚核苷酸可用来分离NA、核蛋白如……㈢.染料亲和吸附剂以染料为配基，用来分离酶类、干扰素等第四节亲和吸附剂的制备一、要求㈠.L与基质结合，对L-S结合无干扰；㈡.L为小分子有的需“手臂”，使L-S结合更有效；㈢.非专一吸附不大，以免吸附杂质；L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。二、偶联用Gel的选择需考虑：㈠.L上可供偶联的基团㈡.“手臂”㈢.L的稳定pH三、由CNBr活化型Sep.4B制备商品名：CNBr-Sepharose一般步骤：冻干粉溶胀洗涤混合反应掩蔽溶解L①②③洗去L（未结合）成品亲和吸附剂的制备过程㈠.溶胀和洗涤用1mol/LHCl溶胀洗涤除细碎粒子㈡.偶联条件注意：前处理、偶联密度、缓冲液种类及pH㈢.掩蔽偶联后有部分氰酸酯未偶联上L，常利用含-NH2的缓冲液或含-NH2的分子处理，将其掩蔽。㈣.洗去未结合L用高-低交叉pH来洗（4～5次）四、由氨基-Sep或羧基-Sep制备Sep-(CH2)6-NH2L-COOHAH-SepSep-(CH2)6-COOHL-NH2CH-Sep碳二亚胺法（配基偶联的一种方法）：还有多种方法可以完成琼脂糖多糖载体活化和配体偶联过程,如:双环氧法等p140-145双环氧法制备亲和吸附剂的原理其他亲和吸附剂聚丙烯酰胺载体的亲和吸附剂可用戊二醛法和肼解法活化,然后再将含氨基的配体固定到其活化基团上;硅胶和多孔玻璃载体的亲和吸附剂最常用的修饰方法就是进行硅烷化处理,从而给载体引入氨基或环氧基团.第五节一般实验方法是否有类专一吸附剂有溶胀Gel无选L选偶联Gel偶联L装柱安装仪器平衡（2～3Vt）加样吸附洗去非吸附物亲和柱洗脱液再生脱盐一、亲和吸附柱的预备㈠.亲和吸附剂选择或制备效能小试：据资料等先选择始缓冲液种类、I、pH、t①.用10Vt始缓洗，若目的物未流出，说明吸附性能好，α＞0.9②.不断加样到目的物流出，确定吸附容量㈡.柱H/D高度专一短类专一长平衡一般2～3Vt始缓二、加样吸附㈠.样品平衡（透析或SephadexG-25）㈡.样品体积Vs（一般＜5%）若结合紧密，Vs可较大；不紧，Vs要小㈢.洗去非吸附物（10Vt始缓洗）三、洗脱（以S不变性为前提）类专一：选择性洗脱、有分级分离要求、梯度或阶式洗脱。高专一：专一洗脱、无分级分离要求、单成分洗脱㈠.pH变化（破坏静电引力）㈡.I变化（减弱静电引力、范德华力）㈢.亲和洗脱L的类似物L′，S的类似物S′*采用酶促反应的多元专一性洗脱㈣.表面活性剂减少疏水作用、范德华力种类常有：曲通X1001%（V/V）、乙二醇等㈤.解离试剂主要破坏氢键，如尿素、盐酸胍等㈥.降低温度t较高t吸附、较低t洗脱、减少疏水力㈦.电泳解吸+在柱两端连上电极进行电泳四、脱盐-五、再生*采用酶促反应的多元专一性洗脱1.三元复合物两元专一性负洗脱E+AEA+BEABAAEA-A洗脱A2.三元复合物三元专一性正洗脱E+AEA+BEAB+A+C洗脱CAEAEACACEACE=乳糖合成酶A蛋白B=α-乳清蛋白E+AEA+BEABA=N–乙酰–D–氨基葡萄糖两元专一性实例负洗脱三元专一性实例正洗脱A=NAD+B=AMPC=PyE=LDH第六节其它亲和色谱简介一、共价色谱利用形成和破坏共价键能力的差异分离其共价键常为二硫键—S-S—主要用于分离分子中含巯基的Pr、多肽基本层析过程……二、疏水色谱将疏水的L连到Gel上作用力—蛋白质的疏水区与疏水性配基间形成疏水键可高盐上柱，低盐洗脱或高温上，低温洗。三、螯合色谱原理HisCysTrp能与某些金属离子形成复合物，若将金属离子固定，可将含这些外露AA的Pr吸附。固定方法：将环氧活化型Sepharose6B与金属螯合剂偶联成配基，再用金属离子处理。如…洗脱：采用增加I或降低pH或加入EDTA原理四、有机染料亲和色谱(p158)原理有机染料如蒽酮化合物和偶氮化合物具类似于NAD+的结构。一些需核苷酸类物质为辅酶的酶，对这些染料具一定亲和力。第七节应用（p161-166)⒈抗体和抗原的纯化⒉酶的纯化⒊糖蛋白和脂蛋白的纯化⒋其它蛋白质⒌细胞的纯化