第10章 甾体激素类药物的分析-2-2013

药物分析学（第十五章）甾体激素类药物的分析（2）本节教师：韩海（博士/副教授)暨南大学药学院Tel:18620908821E-mail:[e-mail]:560118562013.11.11★★第二节鉴别实验1.物理常数2.化学鉴别:——母核和各种官能团的反应★呈色反应、★官能团反应：沉淀反应、卤素反应3.制备衍生物测定熔点4.★紫外分光光度法5.★★红外分光光度法6.色谱法——TLC、HPLC物理常数★★呈色反应★（一）与强酸的呈色反应（甾体母核）与硫酸、磷酸、高氯酸、盐酸等呈色.硫酸呈色反应应用最广1)反应颜色最丰富2)灵敏度较高可能机制为浓硫酸与甾体的酮基质子化反应，形成正碳离子，然后与HSO4-作用。与硫酸显色反应显色荧光加水稀释泼尼松龙深红絮状↓灰泼尼松橙黄→蓝绿炔雌醚橙红黄绿↓红色炔雌醇橙红黄绿絮状↓玫红醋酸可的松黄或微褪色并澄带橙清特点：操作简便，反应灵敏，通过形成的颜色或荧光的不同而互相区别，但操作条件不易掌握。某些甾体激素药物与硫酸—乙醇或硫酸—甲醇作用而呈色。如甲睾酮.雌性激素药物常以硫酸—乙醇的呈色反应来鉴别.例:Chp中雌二醇鉴别取本品约2ml，加硫酸2ml溶解，有黄绿色荧光，加三氯化铁试液2滴呈草绿色，再加水稀释，则变为红色。★★（二）官能团的呈色反应利用官能团的呈色反应可区别不同的药物★★1.C17-α-醇酮基的呈色反应C17-α-醇酮基有还原性，能与氧化剂四氮唑盐反应显色。例:(Chp中醋酸泼尼松鉴别)醋酸泼尼松在碱性条件下与氯化三苯四氮唑试液反应生成红色。[讨论]：1).本反应亦可用于薄层色谱法鉴别甾体激素类药物的显色反应。（如醋酸泼尼松片及眼膏、醋酸氟氢可的松软膏等）2).该呈色反应不仅能用做皮质激素类药物的鉴别和检查(“其他甾体”的检查)，也是该类药物含量测定的依据。3).C17-α-醇酮基还可以和斐林试液、多伦试液发生反应。★★2.酮基的呈色反应C3-酮基、C20-酮基能与2，4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼等羰基试剂反应形成黄色的腙。例如:氢化可的松，其乙醇溶液加新制的硫酸苯肼试液，加热即显黄色。★3.甲酮基以及活泼亚甲基能与亚硝铁氰化钠、间二硝基酚、芳香醛类反应呈色。其中亚硝基铁氰化钠反应是黄体酮的灵敏、专属的鉴别方法。在一定的条件下，黄体酮显蓝紫色，其他常用甾体激素均不显蓝紫色，而呈现淡橙色或不显色。★4.酚羟基的呈色反应C3为酚羟基的雌激素，能与重氮磺酸反应生成红色偶氮染料。JP(14)收载的苯甲酸雌二醇利用该法进行鉴别。含炔基的甾体激素（如炔雌醇、炔诺酮等）白色炔银盐沉淀硝酸银5.★乙炔基沉淀反应RCCHAgNO3RCCAg↓★6.有机卤素反应有机氟Fˉ有机破坏有机氯Clˉ茜素氟蓝硝酸亚铈硝酸—硝酸银AgCl↓呈色卤素在母核上：氧瓶燃烧法破坏如地塞米松磷酸钠卤素在侧链上：加热水解法破坏如丙酸倍氯他索7.酯的反应KOHOCOCHR醇制香OCOCHCHCHSOHOHHCC17或C21位羟基酯，应先水解；再根据羧酸的性质鉴别。例：醋酸酯类药物戊酸、己酸酯类药物，有特臭。制备衍生物测定其熔点[原理]1.甾醇、甾酮类药物可与一些试剂反应生成酯、肟、缩氨脲.测定其熔点进行鉴别。2.利用醇制碱液水解甾体酯类生成相应的母体，测定其熔点进行鉴别。[特点]繁琐费时，但专属性强.目前仍为一些国家药典采用。HO+COClKOHCOO+KCl+H2O炔雌醇m.p.201℃OCCH3O+2HONH2NCHOCH3NOH+2H2O黄体酮双肟m.p.238℃苯丙酸诺龙缩氨基脲m.p.178~185℃分解OCOCH2CH2OC6H5+NH2CNHNH2OHClNCH2NOH+H2O+HAcOCOCH2CH2N+H2OOHO+CH3CH2COOHOCOCH2CH3OKOH丙酸睾丸素m.p.150~156℃★紫外分光光度法[原理]：具有C=C-C=O共轭系统，△４-3-酮～240nm和C=C-C=C共轭系统，苯环（B带：280nm，K带：220nm）1.可用规定波长处的吸收度鉴别如:曲安西龙2.吸收度的比值法。如:丙酸倍氯米松△４-3-酮～240nm★★红外分光光度法[必要性]1.许多重要的甾体激素药物紫外光谱非常相似，紫外光谱鉴别缺乏专属性。2.甾体激素药物化学结构上仅有微小的差异，也难以用化学鉴别法来区分。红外分光光度法的优势1.对样品无破坏,样品用量较少2.特征性极强、信息量丰富:每种化合物都有红外吸收，从红外光谱可以得到大量信息。官能团区的吸收反映了化合物中官能团的特征，而指纹区的吸收对于指认分子提供了可靠的依据。红外分光光度法的应用各国药典几乎均采用红外分光光度法鉴别甾体激素原料药物，中国药典中36种甾体激素原料药物，其中33种采用该方法鉴别！鉴别方法:按规定录制红外光谱图，要求供试品光谱图与对照品光谱图一致。甾体激素药物的红外光谱特征红外光谱主要反映了化合物中官能团的特征.甾体药物中有那些红外活性基团?1.基本骨架：大量的CH3、CH2、CH基团Ⅰ.Ⅱ.δC-H1500~1300cm-1CH32962cm-1，反对称伸缩振动2872cm-1，对称伸缩振动CH22926cm-1，反对称伸缩振动2853cm-1，对称伸缩振动HC2970～2850cm-11375cm-1处的吸收分叉，等高CHH3CH3CCH31460，1375cm-1同时有吸收伸缩振动弯曲振动2.此类药物大部分含有C=C双键a.＝C－H伸缩振动频率大于3000cm-1（峰尖、弱）大约3040～3010cm-1b.C＝C伸缩振动频率在1620～1585cm-1,（峰尖、中等）c.γCH（面外弯曲振动频率）与双键上氢的数目，即取代情况有关。3.此类药物大部分含有羰基羰基峰极强,鉴别价值大.νC=O六员环1720～1705cm-1νC=O五员环1749～1742cm-1νC=OC201710～1706cm-1νC=O△4–3–酮1684～1620cm-14.此类药物还可能含有羟基、醚键等特征结构。甾体激素药物某些基团的红外特征频率★★见书292-293页表10-3炔雌醇的红外吸收光谱CHOHHHOHCH结构特征：苯环、酚羟基、C17–OHC17–乙炔基1505cm-1νOH3505cm-13300cm-1νCHCC1590cm-13610cm-1νOH酚羟基醇羟基1616cm-1苯环的骨架振动CHOHHHOHCH亚甲基、角甲基吸收带γCH苯环指纹区COHHHCH3O黄体酮薄层色谱法[特点]：简便、快速、分离效能高。主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别ChP很多甾体激素制剂均用该法鉴别。[应用范围]：甾体激素制剂的鉴别、纯度检查以及含量测定前的分离和制剂稳定性的研究。[方法]：对照品法1.供试品点样通常需做前处理（如有机溶剂提取），消除注射液、片剂及软膏剂等辅料的干扰。2.要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同。[显色方法]：多用荧光显色法或荧光淬灭法荧光显色高效液相色谱法主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别方法：对照品法一般在含量测定的同时进行鉴别.要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的tR与对照品峰的tR一致。第三节、特殊杂质检查[必要性]：甾体激素药物多由结构改造来，可能带来原料、中间体、异构体、降解产物以及试剂、溶剂等。药典规定检查的重要项目有：★（一）其他甾体（二）硒（三）有机溶剂残留量★（四）游离磷酸盐此外，有些甾体药物还规定其他检查项目。OHH3COOHH3COOHOLi/NH3C2H5OH（可能残留）弱酸雌二醇－3－甲醚（可能残留）苯丙酸诺龙的合成路线I（可能残留）II（可能残留）OHOOCO(CH2)2-C6H5O强酸（可能残留）苯丙酰氯（可能残留）HClIII（可能残留）OHO苯丙酸诺龙的合成路线II（一）其他甾体[定义]：药物中存在的具有甾体结构且与标示药物结构不同的其他化合物都称为“其他甾体”。具有互相不同的药理作用！！有必要检查[来源]：原料、中间体、异构体、降解产物[特点]：（1）可能存在多个甾体杂质（2）结构类似，多数为未知物质分析方法必须具有一定分离能力其他甾体检查法★（一）TLC检查法（高低浓度对比法）使用最为普遍的甾体特殊杂质检查法采用供试品的稀释溶液做对照，以对照溶液斑点颜色为参比来控制杂质限量。中国药典2005版36种甾体激素原料药物，其中33种采用该方法检查特殊杂质！例：教材294页醋酸泼尼松、炔雌醇的杂质检查★[33种甾体激素药物TLC色谱条件的特点总结]：1.薄层板：大多采用硅胶G板，少数采用硅胶GF254或硅胶HF254。2.溶剂:氯仿-甲醇/甲醇/氯仿/丙酮3.展开剂系统：首选不同比例的二氯甲烷-乙醚-甲醇-水混合溶剂。（其他：苯/无水乙醇/二氯甲烷-甲醇-水/氯仿-甲醇等）4.显色剂：首选碱性四氮唑蓝试液。（其他：硫酸-乙醇/浓硫酸/10%磷钼酸-乙醇）5.检测法：紫外灯(254nm/365nm)/日光检视。TLC判定方法规定杂质斑点数目规定杂质斑点颜色供试品溶液如显杂质斑点，不得多于XX个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。——高低浓度对比法雌二醇杂质检查TLC图特点：（1）简便易行，不需特殊的仪器；（2）不需对照品；（3）要求杂质斑点与主成分斑点的颜色相近且显色灵敏度也接近。（4）不能控制全部杂质的限量；也不能控制杂质的总量自身对照（二）HPLC法[方法]：1.自身对照法（加/不加校正因子）采用供试品的稀释溶液做对照，以对照溶液主峰面积为参比来控制杂质限量。例：教材295页黄体酮杂质检查为不加校正因子的自身对照法。2.主成分归一化法（HPLC-UV法检测灵敏度较低时）对照溶液——0.02mg/ml供试液——1mg/ml黄体酮中有关物质检查供试品溶液的杂质峰数不得超过1个，其面积不得大于对照液的主峰面积的3/4[甾体激素药物HPLC色谱条件的特点总结]：1.色谱柱：十八烷基硅烷键和硅胶。2.流动相：各种不同比例的甲醇-水混合溶剂。3.检测器：紫外（214nm/254nm/281nm，230nm/288nm）4.判定方法:规定杂质峰数目规定杂质峰面积HPLC法进行药物特殊杂质检查的特点（1）需特殊的仪器；（2）不需对照品；（3）可以控制杂质的总量；（4）杂质与主成分测定的灵敏度可以不同。（用校正因子消除）（二）硒的检查来源合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢原理nmA环己烷苯并苯硒二唑二氨基萘,Se,..pHSeSe盐酸羟胺氧瓶燃烧方法剧毒含硒物质限量﹤0.01%（三）有机残留溶剂的检查[必要性]：甾体激素药物在生产工艺中使用大量有机溶剂。（特别是甲醇和丙酮）测定法：GC法示例：地塞米松磷酸钠有机残留溶剂的检查方法。（教材396页）判定标准1.甲醇不得超过0.3%（g/g）2.丙酮不得超过0.5%（g/g）内标法+校正因子定量!限量确定的原则▲药品注册的国际技术要求（ICH）规定甲醇——第二类毒性溶剂——限量0.3%（g/g）丙酮——第三类低毒性溶剂——据生产实际情况确定限量（四）游离磷酸盐的检查凡甾体激素药物的磷酸盐均需检查.ChP规定要检查的药物有:地塞米松磷酸钠氢化可的松磷酸钠倍他米松磷酸钠氢化泼尼松磷酸钠[方法]:对照品法(标准磷酸盐溶液对照)原理：OnHMoOPHPOHPOMoOH24103433424经还原钼蓝　对照液供试液对样还原钼酸铵AAnm方法：（对照液0.0035%KH2PO4）POKHPOH%.%..L%5.0第四节、含量测定