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碱性磷酸酶米氏常数的测定浙江中医药大学生命科学学院生物化学教研室[目的与要求]1.通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方法及意义。2.学会运用标准曲线测定酶的活性，加深对酶促反应动力学的理解。[原理]酶催化底物发生反应时，受多种因素影响，环境的温度、pH和酶的浓度等等，在环境的温度、pH和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现在反应开始时。酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应速度(Vmax)，如图37所示底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示。V=Vmax[S]/(Km+[S])上式中Vmax为最大反应速度，[S]为底物浓度，Km为米氏常数(Michaelisconstant)，而其中V则表示反应的起始速度。当V=Vmax/2时，Km=[S]。所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。因此Km的单位以摩尔浓度(mol／L)表示。Km是酶的最重要的特征性常数，测定Km值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的Km值在0.01-100(mmol/L)间。酶促反应的最大速度Vmax实际上不易准确测定，Km值也就不易准确测出。林-贝(1ineweaver-Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方程式，即：(两边取倒数）1/V=（Km+[S]）/Vmax[S]或1/V=Km/Vmax·（1/[S]）+1/Vmax(得类似：y=ax+b的直线方程）y=1/V，a=Km/Vmax，x=1/[S]b=1/Vmax此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/Km，由此可以正确求得该酶的Km值，如图所示。本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算其Km值。可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反应的酶对于不同的底物有不同的Km值。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光度的大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上查知酚的含量，进而算出酶活性的大小。反应式如下：三、[试剂与器材]1．0.04mol/L基质液2．0.1mol／L碳酸盐缓冲液pH10(37℃)3．碱性溶液4．0.5％铁氰化钾5．0.3％4-氨基安替比林6．酚标准液(0.1mg/mL)7．37℃恒温水浴锅8．可见光分光光度计四、[操作步骤]1．酚标准曲线的绘制：酚含量（μg）：0510203040(2)混匀后室温放置15分钟，于510nm波长处比色。(3)以酚含量(μg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制酚标准曲线2.底物浓度对酶促反应速度的影响最终基质浓度单位：µmol/ml(2)加入血清后，各管混匀并且立即记录时间，将上述各管置37℃水浴中准确保温15分钟。(3)保温结束，立即加碱性溶液1.1mL终止反应。(4)各管分别加入0.3％4-氨基安替比林1.OmL，0.5％铁氰化钾2.0mL，充分混匀，放置10分钟，以6号空白管作对照，于510nm波长处比色测定，根据酚标准曲线计算酶活性。(5)以各管基质浓度的倒数1/[S]为横坐标，以各管吸光度的倒数或者以酶活性单位的倒数1/V作纵坐标，作图求出Km值。[结果与计算]在37℃保温15分钟，每生成1mg酚为一个酶活性单位，以标准曲线查出释放酚量(μg)即可算出酶活性。100mL血清中酶活性=释放的酚量×（1/0.1）×100×（1/1000）=释放的酚量（μg）（释放酚量（μg）、1/0.1--0.1为实际取血清0.1ml、100为100ml血清、1000为μg变为mg。）[注意事项]1．血清取量要准确2．标准曲线必须是一条直线（一）Km值测定的意义1.当反应速度为最大速度一半时，Vm=1/2Vmax，Km=[S]Km是指底物的浓度，含义：Km值等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度。2.Km值可表示酶对底物的亲和力。Km值愈小，酶与底物的亲和力愈大；表示不需要很高的底物浓度便可容易地达到最大反应速度。3.Km值是酶的特征性常数之一，只与酶的结构、酶所催化的底物和反应环境相关，与酶的浓度无关。各种酶的Km值范围很广。大多数酶在0.01-100mmol/L间；对于同一底物，不同的酶有不同的Km值；多底物反应的酶对于不同底物也有不同的Km值。（二）酶活性（U/L）1.酶活性单位：在特定条件下，酶促反应在单位时间内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所需的酶量。2.酶活性国际单位（IU）：按照国际酶学会议的规定，1个酶活力单位是指在25℃、测量的最适条件（指最适pH、温度等）下，1分钟内能引起1微摩尔底物转化的酶量。课后复习题1.写出林贝方程2.简要叙述碱性磷酸酶Km测定方法