常见深部真菌形态学

厚德·精医·求实·创新标本直接涂片形态学在常见IFD中的诊断价值江西省人民医院检验科陈会2018.07  武汉厚德·精医·求实·创新IFD诊治现状高感染率低诊断率低治疗率高死亡率厚德·精医·求实·创新真菌学实验室所需的核心诊断测试测试感染诊断灵敏度周转时间镜检侵袭性感染、皮肤、毛发和指甲、外阴阴道念珠菌病30-90%2小时抗原检测隐球菌脑膜炎99%2小时呼吸道样本的PCR肺孢子菌肺炎98%1天血清和呼吸道样本的抗原ELISA试验侵袭性曲霉菌病(组织胞浆菌病)80%2天葡聚糖检测大部分真菌感染，高阴性预测值(NPV)代表可以停止用药65-77%2天烟曲霉IgG抗体慢性肺曲霉病80-95%2天烟曲霉IgE抗体过敏性支气管肺曲菌病的哮喘筛查95%2天真菌培养和鉴定所有除肺孢子菌肺炎以外10-50%3-14天组织病理学阳性、培养阴性样本的分子诊断所有，特别是霉菌感染50-60%7天伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑血液浓度曲霉菌病100%3天厚德·精医·求实·创新标本直接涂片常用方法不染色1.直接湿片暗视野观察：血培养阳性瓶，液体标本2.10-20%KOH或消化液消化后，浓缩集菌后镜检染色1.革兰染色2.六胺银染色3.墨汁染色4.荧光染色：产黑色素真菌不能有效着色，国产试剂目前PJP无法着色其他1.吉姆萨染色2.甲苯胺蓝染色3.巴氏染色4.HE染色5.PAS染色6.……厚德·精医·求实·创新“四大恶菌”，各有千秋，特点鲜明！种属来源正常菌群主要感染部位感染方式主要的免疫防御宿主念珠菌自身（内源）奶制品、水果是血流，深部器官（肝脾肾眼底），腹腔，尿路组织侵袭/播散生物屏障皮肤黏膜屏障单核/巨噬细胞和PMNs免疫低下：粘膜入侵免疫正常：导管曲霉菌环境（腐败有机物）否肺组织侵袭生物屏障粘液-纤毛AMs和PMNs免疫正常~重度低下（不可逆转粒缺）肺孢子菌人（宿主特异性）是肺增殖肺泡巨噬细胞免疫低下隐球菌环境（鸽子粪）否中枢，肺，血流，皮肤，骨骼…组织侵袭/播散生物屏障皮肤黏膜屏障单核巨噬细胞和PMNs免疫正常~重度低下厚德·精医·求实·创新一、念珠菌属检出不是问题！革兰染色即可！涂片的作用：“防漏”：临床忽视、经验用药、实验室主观失误“打假”：区分定植、污染和感染！厚德·精医·求实·创新1、念珠菌重要的微生物学特性有哪些？常见种：白念、热带、近平滑、光滑、克柔感染源：植物、奶制品及水果（外源），人体各有菌部位（内源），内源＞外源胃：强酸环境，乳杆菌及念珠菌为原籍菌营养要求不高，生长速度多数较快昀厉害的武器：“酵母⇆菌丝”——LoHJ,etal.1997.NonfilamentousC.albicansmutantsareavirulent.Cell90:939–949.特殊患者（血液系统恶性疾病）毒力排序：热带＞白念＞其他念厚德·精医·求实·创新生物屏障受损抗菌药物暴露念珠菌定植荷载增加免疫屏障受损糖尿病激素免疫抑制剂粒缺干细胞移植++菌血症：ICU腹腔念珠菌病：普外尿路感染：泌外菌血症：血液科肺炎尿路感染肝、脾、眼底脓肿2、侵袭性念珠菌病（IC）的发病机制机械屏障受损血管内置管腹透置管化疗致粘膜溃疡消化道穿孔、吻合口漏++尿路梗阻、导尿心内膜炎、植入物生物被膜…厚德·精医·求实·创新3、念珠菌深部侵袭感染常见临床类型有哪些？菌血症：粘膜侵袭（粒缺）、导管相关性（非粒缺）腹腔念珠菌病：上消化道穿孔（胃十二指肠）、下消化道来源（术后7~15天）尿路感染：逆行：糖尿病、广谱抗生素暴露、侵入性操作、尿路梗阻血源播散播散型感染（粒缺）：肝脾眼底脓肿、心内膜炎、血播肺炎…透析相关性腹膜炎植入物生物被膜……厚德·精医·求实·创新4、病例1：防漏（临床没考虑到）4月17日行“胃穿孔修补+腹腔清洗术”4月17日~19日：哌拉西林/他唑巴坦+甲硝唑，病情平稳4月20日~：出现低热，泰能美国外科感染协会（Surgical Infection Society，SIS）腹腔感染指南（2017）6.SelectionofempiricantimicrobialtherapyforadultpatientswithCA-IAI：Donotuseantifungalagentsroutinelyforempirictherapyofhigher-riskpatients(Grade1-B).Consideruseofantifungalagentsforempirictherapyofcriticallyillpatientswithanuppergastrointestinalsource(Grade2-B).厚德·精医·求实·创新病例2：防漏（经验用药）厚德·精医·求实·创新病例3：防漏（实验室）厚德·精医·求实·创新问题来了！什么地方的脓液？引流的？开放性伤口的？闭合性脓肿术中获取？为什么涂片有而培养不长？药死了？长得慢？这念有意义么？厚德·精医·求实·创新患者情况青年男性糖尿病，未规范降糖左肾周血肿，彩超引导下穿刺引流获取脓液送检前未使用抗真菌药物厚德·精医·求实·创新怎么办？建议临床：念珠菌感染概率极高建议经验性抗念珠菌治疗先出具涂片镜检报告平板继续孵育48h，待长出菌落行鉴定药敏厚德·精医·求实·创新5、打假呼吸道分泌物：几乎无意义（吸入性肺炎除外）尿液：大多数源自尿袋和/或导尿管粪便：大多数仅仅为菌群紊乱，“粒缺”患者有“预警”意义厚德·精医·求实·创新例4：打架之一（呼吸道分泌物）厚德·精医·求实·创新呼吸道分泌物（咳痰、吸痰、BAF、）培养阳性率极高培养前抗生素的使用：上呼吸道优势菌受抑制或杀灭，定植抗力减弱，念珠菌大量繁殖标本留取不合格：上呼吸道分泌物污染本实验室做法：仅报告生长大概数量，不做鉴定药敏厚德·精医·求实·创新打假之二：尿袋尿！厚德·精医·求实·创新厚德·精医·求实·创新二、曲霉菌曲霉菌孢子直径2~5μm，易在空气中悬浮，其中烟曲霉菌孢子昀小2~3μm，更易到达下呼吸道而不易被清除；正常空气1~100个孢子/m3，人每天可吸入100~1000个孢子曲霉菌生长迅速，常见种（烟曲、黄曲）耐受温度及pH范围广，且35度生长明显快于28度烟曲霉孢子比其它曲霉菌孢子疏水性更强（更易在空气中播散）非人体正常菌群Although able to cause disease in humans, A. fumigatus does not typically colonize the human respiratory tract. *不合格咳痰少见曲霉实验室常见的污染真菌之一*FrankL.vandeVeerdonk.Aspergillusfumigatusmorphologyanddynamichostinteractions.NatRevMicrobiol.2017Nov;15(11):661-674.1、重要的微生物学特点？厚德·精医·求实·创新2、曲霉菌最显著的临床特点？“两面”致敏原致病原“三刀”气道侵袭气腔侵袭血管侵袭“一条道”吸入致感染（肺部感染）厚德·精医·求实·创新曲霉菌肺部感染临床类型——“会变的疾病”•FrankL.vandeVeerdonk.AspergillusfumigatusmorphologyanddynamichostinteractionsNatRevMicrobiol2017Nov;15(11):661-674厚德·精医·求实·创新3、涂片适用于哪些曲霉菌感染临床类型？IPA：重度免疫抑制宿主（粒缺）：不适合！1.感染所需荷载菌量少2.病情进展快，血管侵袭＞气道侵袭3.致病原过敏原：痰少或无咳嗽轻中度免疫抑制宿主（COPD）/免疫功能正常：合适！感染所需菌量大气道侵袭受累时间长、程度高，病情逐步发展至血管侵袭既有感染又有过敏：咳嗽痰多、呼吸困难肺曲霉球：不适合！CPA：可以有！ABPA：为诊断指标之一曲菌侵袭气道受累及的患者！厚德·精医·求实·创新4、不同染色方法优缺点染色方法优点缺点10~20%KOH1、廉价2、敏感性高3、操作简单1、强碱使用2、菌丝结构革兰染色1、廉价2、操作简单3、可观察WBC与菌丝之间的关系1、敏感性相对低六胺银染色1、廉价2、敏感性高3、菌丝结构清晰1、操作繁琐2、试剂不稳定荧光染色1、操作简单2、敏感性高3、快速1、贵2、需荧光显微镜均需感性认识积累！厚德·精医·求实·创新厚德·精医·求实·创新曲霉菌菌丝在革兰染片中不均匀分布厚德·精医·求实·创新卢先雷老师供图！厚德·精医·求实·创新曲菌菌丝革兰染色多呈阴性或不着色，多被粘液丝和/或WBC包裹！厚德·精医·求实·创新银染：菌丝棕黑色，组织细胞背景色（淡绿→绿色；伊红→红色）厚德·精医·求实·创新银染菌丝结构最清晰！厚德·精医·求实·创新荧光染色敏感性最高，最快！“一滴”“一盖”“一吸”“一看”厚德·精医·求实·创新厚德·精医·求实·创新神马情况？患者男，64岁，近8年反复咳嗽、咳痰、气喘，冬季加重。近3年气喘明显加重，爬三层楼需休息，平均每年在当地诊所输液6次，曾住院治疗过1次。1月前气喘明显加重，咳嗽较剧烈，咳较多黄绿色痰，夹杂褐色痰，至当地诊所输液（具体不详），治疗6天后无好转。2018-1-19入宿迁市人民医院急诊抢救室。血常规：WBC 10.7×109/L，N 84.1%；ABG：pH 7.367，PaO252.1mmHg，PaCO257.6mmHg，SaO288.6%，静推甲强龙40mg，静滴氨茶碱后气喘稍好转。1月20日转入该院呼吸科病房，静滴左氧+比阿培南+氨茶碱（剂量不详），静推加强龙40mg 2次/日，气喘明显好转。1月24日体温升高至37.6℃。1月27日体温波动在38-39℃，多于傍晚出现发热。甲强龙减量静推20mg 2次/日，余同前。1-26、1-28及1-31痰培养均为XDR鲍曼不动杆菌（替加环素、复方新诺明、庆大霉素、妥布霉素敏感）。1-29胸部CT：慢支、肺气肿、两肺肺大疱，两肺多发斑片及条索影1-30停左氧及比阿培南，静滴替加环素，体温仍波动于38℃左右，仍咳黄痰。厚德·精医·求实·创新2018年2月2日血常规：WBC39.7×109/L，CRP152mg/L，BALF液两份GM分别为0.75ug/L、1.51ug/L；静滴伏立康唑及利奈唑胺2-3甲强龙减量为10mg ，2次/日静推，2-3及2-4体温正常，2-5体温再次升高，热峰为38.5℃，多为早晨发热，伴明显畏寒2-6血常规：WBC 26.8×109/L，CRP 95.58mg/L2-8痰培养再次回报为XDR鲍曼，遂当日将伏立康唑+利奈坐胺方案为改为静滴伏立康唑+替加环素，但患者仍有发热，体温波动于38.5-39℃，咳嗽无好转2-10痰培养再次为泛耐药鲍曼不动杆菌2-11复查血常规：WBC 13.28×109/L，CRP41.9mg/L2-12复查胸部CT两肺支扩伴感染、慢支肺气肿2-12调整抗感染方案：静滴替加环素+利奈坐胺，口服伏立康唑，仍有发热，热峰较前无变化，2018-2-13自动出院，出院后体温波动于38-39℃，咳嗽明显，时有黄褐色痰，胸闷气急2月17日再次入院：换了家医院！厚德·精医·求实·创新多次痰、BAF培养涂片均未见曲霉！3月1日经皮肺穿刺分别送检病理、华大基因高通量测序，均未获阳性结果谋求病原学，锲而不舍！厚德·精医·求实·创新厚德·精医·求实·创新5、直接涂片形态学对曲霉诊断需要注意的标本直接涂片中，曲霉菌、镰刀菌和赛多孢菌菌丝形态接近，无法区分不典型曲霉菌菌丝形态与毛霉目真菌（接合菌）接近，区分困难涂片见曲霉菌丝（合格标本）并不能作为启动治疗的唯一依据厚德·精医·求实·创新谁是曲霉？厚德·精医·求实·创新银染HE染色糖原染色谁是曲霉？厚德·精医·求实·创新都是毛霉么？都是毛霉么？厚德·精医·求