分子诊断学遗传性疾病的分子诊断

Chapter15遗传性疾病的分子诊断1.Therearemanydifferenttechniquesthatcanbeusedtodiagnosetheglobingenemutations,includinggap-PCR,ARMS-PCR,andREanalysisofamplifiedproduct.globin：球蛋白KeyPoints2.HemophiliaisacongenitaldiseaseofthecoagulationdisorderswhichconstituterecessivedisorderslinkedtochromosomeX.ThestudywascarriedoutbytheSSCP,RELP,Southernblot,VNTR,andSTR.hemophilia：血友病；congenitaldisease：先天性疾病；coagulation：凝固，凝结；recessive：隐性3.TwomultiplexPCRsareconstructedinwhich9exonscanbeamplifiedsimultaneously,and98%ofalldeletionscanbeidentified.multiplex：多样化；exon：外显子；simultaneously：同时地；deletion：缺失4.Phenylketonuriaisaninbornerrorofmetabolismresultingfromadeficiencyofphenylalaninehydroxylase.Therearemanytechniquesthatcanbeusedtomutationscreening,suchasPCR-STR,PCR-SSCP,PCR-RFLP,PCR-DGCE,andsoon.Phenylketonuria：苯丙酮尿phenylalaninehydroxylase：苯基丙氨酸羟化酶5.Cysticfibrosis(CF)iscausedbymutationsintheCFTRgene.Fivetestsaremostfrequentlyused:resctrictionenzymeanalysis,theheteroduplexanalysis,ARMS,reversehybridizationandOLA.Cysticfibrosis：囊胞性纤维症heteroduplex：异源双链核酸分子Hybridization：杂交6.Huntington’sdisease(HD)involvesapolymorphic(CAG)repeatsequencelocatedinexon1oftheIT15geneat4p16.3.HDcanbeaccuratelyconfirmedorexcludedbyPCR-basedassay.Huntington’sdisease(HD)：亨廷顿病7.FragileXdiseaseresultsfromtrinucleotide(CGG)repeatexpansions.Atpresent,diagnosticproceduresoffragileXdiseasearebasedonSouthernblottingandonPCRamplification.FragileXdisease：脆性X综合征trinucleotide：三核苷酸8.TwomajortechnologiesareinuseforPNDandPGD:PCRformonogenicdiseasesandFISHforchromosomalaberrations.monogenic：单基因的遗传性疾病的分子诊断（moleculardiagnosisofgeneticdisease）是指通过分析患者体内遗传物质结构或表达水平的变化，对人体健康状态和疾病做出或辅助诊断的方法。评估基因的存在和缺陷通常以DNA为材料评估基因的表达量则以基因转录或翻译RNA/蛋白质为对象Section1遗传性疾病分子诊断的策略所有遗传性疾病都与某种或多种基因的突变有关。基因突变的概念：遗传物质的各种遗传性改变称基因突变（mutation），其实质是核苷酸的增添、缺失、替代、颠倒和转位。自然条件自发突变人为干预诱发突变携带突变的生物个体或群体称为突变体（mutant）对遗传性疾病的分子诊断有三种策略可供选择：1.直接诊断策略；2.基因多态性连锁分析；3.基因突变的定量一．直接诊断策略通过分子生物学技术直接检测导致遗传性疾病的各种基因突变。因此其前提是被测基因已经被克隆，其核酸序列和机构已被阐明。1.点突变的诊断：即DNA分子中的一个碱基被另一个碱基所替换，其后果取决于替换的性质和位置点突变背景清楚或部分清楚：allelespecificoligonucleotide,ASO、PCR-ELISA、allelespecificamplification,ASA、PCR-RFLP、基因芯片点突变背景未知：single-strandconformationalpolymorphism,SSCP、denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE、heteroduplexanalysis,HA、DNA序列测定、proteintruncationtest,PTT2.片段性突变的检测：指DNA分子中较大范围的碱基发生突变方法：Southernblotting、多重PCR二．基因多态性连锁分析间接诊断，在家系中进行连锁分析和关联分析单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）,第3代遗传标记三．基因突变的定量诊断Section2遗传病的分子诊断一．血红蛋白病血红蛋白病（hemoglobinopathy,Hb）是由于编码血红蛋白的基因异常而发生的一类遗传性贫血病。主要分为两大类：1.异常血红蛋白病，Hb发生结构上的异常，导致贫血病，例如镰刀状细胞贫血2.地中海贫血，构成Hb的蛋白部分-珠蛋白的合成降低或消失，也称珠蛋白合成障碍性贫血α珠蛋白基因&β珠蛋白基因镰刀状细胞贫血（sicklecellanemia）1.镰刀状细胞贫血的分子机制第一个成功在分子水平得以解释的人类疾病2.镰刀状细胞贫血的分子诊断方法最常用的是限制性内切酶法（RE）地中海贫血（thalassemia）由于珠蛋白基因缺失或突变导致某种珠蛋白链合成速率降低，造成α链和非α链合成不均衡，引起溶血性贫血。按照合成速率降低的珠蛋白类型分为α、β、γ、δ地中海贫血α-地中海贫血（α-thalassemia）α0地贫是α链完全不能合成者α+地贫是部分α链合成者HbBartˊs水肿综合征HbF为α2γ2α链减少形成γ4聚体HbH病HbA为α2β2α链减少,形成β4聚体具有较高的氧的亲合力，使组织供氧不足导致贫血1.α地中海贫血的分子机制缺失型α+地贫α0地贫1）α+地贫：左侧缺失：α2基因右侧缺失：α2基因3ˊ端和α1基因5ˊ端构成融合基因2)α0地贫①缺失α珠蛋白到α1基因5ˊ端缺25kb②只有ζ基因缺17.4kb③ζ和Ψζ基因缺17.5kb④缺失α2基因和α1基因5ˊ端缺5.2kb3）非缺失型α地贫中国人非缺失型HbH病病因：α2基因的125位密码子CTG（亮）突变CCG（脯),妨碍α1β1二聚体的形成，导致贫血2.分子诊断方法PCR法、ARMS法、ASA法、SSCP法、等位基因特异性扩增技术（ASPCR）法1）重型β地中海贫血：β0/β0和β0/β+β链合成减少，γ链合成增加，HbF对氧亲和力高，是组织缺氧2）轻型β地中海贫血：β0/βA和β+/βA3）δβ地中海贫血：β和δ基因缺失导致β链、δ链不能合成•β地中海贫血是β珠蛋白基因突变和部分缺失导致β链合成速率降低。β地中海贫血的分子诊断方法PCR-RDB法、PCR-ASO法、ASPCR法、突变寡核苷酸延伸扩增PCR（mutantoligonucleotideextentionamplification,MOEA）法、多重等位基因特异PCR（multiplexallelespecificPCR，MAS-PCR）法、基因芯片法二．血友病（hemophilia）多数凝血因子是蛋白质，由其有关的基因编码。由于这些基因的缺陷而使其中某一凝血因子蛋白表达降低或缺失即造成血友病1.甲型血友病概念：抗血友病球蛋白（antihemophilicglobulin,AHG)遗传性缺乏所致临床表现：出血不止分子基础：FⅧ由26个外显子（9kb）25个内含子（177kb）编码2351个氨基酸分子诊断方法：基因倒位检测和非基因倒位检测①基因倒位检测：LD-PCR（长距离PCR）②非基因倒位检测：PCR-RFLP法、VNTR法、STR法、PCR-SSCP法2.乙型血友病概念：凝血因子Ⅸ即血浆凝血活成分（PTC）遗传性缺乏临床表现：出血部位：肌肉、关节、深部组织分子基础：FⅨ，长度34kb，8个外显子和7个内含子以及侧翼顺序中调控区域构成分子诊断方法：直接和间接方法检测①直接检测方法：直接测序法、基因芯片法和毛细管电泳②间接检测方法：RFLP法、SSCP法、DGGE法、双脱氧指纹图谱、变性高效液相色谱法三．肌营养不良症（hemophilia）主要有杜氏肌营养不良症（Duchennemusculardystrophy,DMD）和贝氏营养不良症（Beckermusculardystrophy,BMD）发病机制：抗肌萎缩蛋白基因的突变导致肌细胞膜上的抗肌萎缩蛋白发生结构和功能的改变所致抗肌萎缩蛋白基因：DMD基因包括79个外显子和78个内含子，全长约2.3×106bp，是目前已知人类最大的基因分子诊断方法：①多重PCR技术②短串联重复序列（shorttandemrepeat,STR）连锁分析③定量PCR技术④RT-PCR技术四．苯丙酮尿症（phenylketonuria,PKU）主要是由于肝内苯丙氨酸羟化酶（phenylalaninehydroxylase,PAH）严重缺失所致的苯丙氨酸代谢异常，为常染色体隐性遗传病临床表现：智力障碍、色素减少、尿特殊气味及神经和精神症状分子诊断方法：①PCR-STR连锁分析②PCR-RFLP③多重ASPCR法④PCR-DGGE法五．囊性纤维化（cysticfibrosis,CF）由囊性纤维化穿膜传导调节因子（cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator,CFTR）基因突变所致临床表现：极易发生呼吸道感染而引起气道梗阻及呼吸功能不全，多数患者仅能成活数年到10余年分子诊断方法：①PCR-SSCP法②HA法③ARMS法④反向杂交（reversehybridization）结合酶联免疫法⑤OLA法⑥基因芯片法六．亨廷顿病（Huntington’sdisease,HD）是一种有IT15基因上CAG重复序列异常扩展所致常染色体显性遗传的以舞蹈运动为主要特征的神经退行性疾病。临床表现：进行性恶化的运动、认知及精神障碍的三联征。七．脆性X综合征(fragileXsyndrome,FraX)遗传性智力缺陷疾病FMR-1基因分子诊断方法：①Southernblotting②PCR法③微卫星序列分析法Section3产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷的分子诊断产前诊断（prenataldiagnosis,PND）就是在胎儿出生以前，通过对某些特异基因进行分析，以判断胎儿是否有某种遗传性疾病的手段。植入前遗传学诊断（preimplantationgeneticdiagnosis,PGD）一．染色体异常分子诊断1.荧光原位杂交（FISH）2.比较基因组杂交3.间期染色体转化二．单基因病的产前（植入前）分子诊断1.PND和PND可诊断的单基因病2.PND和PND诊断单基因病的分子诊断技术①巢式PCR②全基因组扩增（WGA）③多重PCR④荧光PCR⑤突变分析法