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实时荧光定量PCR技术的原理(RealtimeQuantitativePCR)吴智明实时荧光定量PCR定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。与普通PCR的区别普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光阈值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为CT值（thresholdvalue）。荧光定量PCR化学原理非特异性荧光标记：1、SYBRGreen特异性荧光标记：2、TaqMan1、SYBRGreen法SYBRGreen熔解曲线分析溶解曲线溶解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线，随着反应中双链DNA变性，荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次倒数与温度作图，在扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50％的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度溶解.SYBRGreen法优缺点优点:对DNA模板没有选择性适用于任何DNA使用方便--不必设计复杂探针非常灵敏便宜2、TaqMan探针法TaqMan作用机理TaqMan法优缺点Real-timePCR临床应用荧光定量PCR在病原体检测中的应用一肝炎病毒定量检测二性病病原体检测三结核杆菌及呼吸道病原体检测四优生优育(TORCH)相关项目检测临床应用HBV（二）HBV-DNA与“两对半”1.“两对半”：机体的免疫反应状态；2.“携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能反应体内病毒复制水平与感染程度。FQ-PCR：检测的是HBV本身的遗传物质—DNA，是病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。3.血清学指标(－)不能排除HBV感染。HBV（二）HBV-DNA与“两对半”HBsAg(－)HBV-DNA(＋)HBeAg(－)HBV-DNA(＋)4.也可能出现HBsAg(＋)，HBV-DNA(－)。5.HBsAb(＋)、HBcAb(＋)、HBeAb(＋)三抗体阳性与HBVDNA2.5×103copy/ml结果解释。(1)HBV基因变异，如S区和前S区的变异，可影响HBsAg的表达或改变其抗原性；(2)HBV-DNA基因重排：HBV-DNA基因整合到宿主染色体中，可导致DNA序列重排，进而影响HBsAg表达。(3)患者因素：患者处于HBV感染的恢复早期，体内HBsAg水平很低，或患者体内存在长期的低水平HBV复制，采用普通的酶联免疫吸附试验不能检出。(4)HBsAg免疫复合物的形成：免疫复合物中的抗体封闭复合物内抗原，试剂中抗体不能与复合体内抗原结合，从而致HBsAg假阴性结果。HBV(三)HBV-DNA定量检测的临床意义3.HBV-DNA定量与预后a.含量高者急性肝炎患者易慢性化b.癌变的几率明显高于含量低者1.HBV-DNA定量与HBV复制水平及传染性2.HBV-DNA定量与乙肝药物疗效a.专家提出103copy/ml做为阴性或临床治愈标准b.HBV-DNA定量分析与干扰素治疗(前、中、后)c.拉咪呋啶HBV(三)HBV-DNA定量检测的临床意义4.HBV-DNA定量有助于指导怀孕与孕期，哺乳期检查5.肝脏移植与HBV-DNAMazzaferro等报告：103copy/ml无一例再发肝炎105copy/ml发生了严重HBV再感染6.血液制品和献血员的筛选二常见性传播疾病病原体一淋球菌（NGH）二沙眼衣原体（CT）三解脲脲原体（UU）四梅毒螺旋体（TP）五单纯庖疹病毒（HSV）六乳头瘤病毒（HPV）七人类免疫缺陷病毒（HIV）八EV71A16通用型1.非培养或形态学检查的诊断技术，快速、特异、敏感。2.对无症状或症状轻者，可以早期确诊。3.对NGH、CT、UU等混合感染者，诊断和鉴别诊断。4.指导用药、考核疗效。荧光定量PCR诊断NGH/CT/UU的意义NGH/CT/UUNGH/CT/UU荧光定量PCR诊断NGH/CT/UU的意义5.不孕不育、优生优育。6.流行病学调查，为性传播疾病的监控提供依据。绝对定量：从荧光到拷贝数标准品标准品梯度稀释方法谢谢！