基因功能研究方法进展

基因功能研究方法进展王江河南农业大学牧医工程学院基础兽医系动物生理生化教研室基因的发现：孟德尔-遗传学之父孟德尔的豌豆杂交实验基因的本质：肺炎链球菌转化实验基因突变：镰刀形红细胞贫血症N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽链HbAβ肽链N-val·his·leu·thr·pro·val·glu·····C(146)基因的分子结构：DNA双螺旋的发现基因是指携带有遗传信息的DNA序列，是控制性状的基本遗传单位亦即一段具有功能性的DNA序列。现代关于真核基因的认识1.真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞内的基因的基因组是双份的（即双倍体,diploid），即有两份同源的基因组。2.真核细胞基因转录产物为单顺反子。一个结构基因经过转录和翻译生成一个mRNA分子和一条多肽链。3.存在重复序列。4.基因组中不编码的区域多于编码区域。5.大部分基因含有内含子，因此，基因是不连续的。真核基因组的特点基因的操作：DNA重组技术•1951年，美国学者E．莱德伯格等发现了噬菌体。1957年日本学者发现了抗药性质粒。•20世纪70年代初，生物化学研究的进展也为重组DNA技术奠定了基础•1978年，诺贝尔生医奖颁给发现DNA限制酶的纳森斯、亚伯与史密斯时，斯吉巴尔斯基在《基因》期刊中写道：限制酶将带领我们进入合成生物学的新时代。•基因工程、遗传工程、分子克隆作为DNA重组技术的代名词被广泛使用。DNA重组技术的原理•1.目的基因的获取•2.克隆载体的选择与构建•3.外源基因与载体的连接•4.重组DNA导入受体菌•5.重组体的筛选•6.克隆基因的表达经典遗传学的认知路线为由表及里，即通过杂交等手段观察表型性状的变化而推知遗传基因的存在与变化。随着分子遗传学及相关实验技术的发展，已经能够在分子水平上进行操作，有目的地对DNA进行重组或者定点突变(invitrosite-directedmutagenesis)等。因此，现代遗传学中就出现了另一条由里及表的认知路线，即通过DNA重组等技术有目的地、精确定位地改造基因的精细结构以确定这些变化对表型性状的直接影响。由于这一认知路线与经典遗传学刚好相反，故将这个新的领域作为遗传学的一个分支学科，称为反向遗传学。基因功能研究：反向遗传学提纲一、基因功能研究的常用方法1.基因过表达（Overexpression）-gainoffunction1)瞬时过表达（Transientexpression）：游离型载体：pCpGfree，MinicircleDNAetal.2)稳定过表达（Stableexpression）：PiggyBacTransposonSystem，phiC31，Lentivirus2.RNA干扰（RNAinterference）-lossoffunction二、基因组编辑技术（Genomeediting）1.基因打靶技术（Genetargeting）2.锌指核酸酶技术（Zincfingernucleases,ZNFs）3.转录激活子样效应因子核酸酶技术（TranscriptionActivatorLikeEffector,TALENs）4.成簇的间隔短回文重复序列系统（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeat,CRISPR/Cas）5.DNA-guidedgenomeediting:NgAgo(韩春雨)，Structure-guidedendonuclease一、基因功能研究的常用方法1.基因过表达方法（Overexpression）-瞬时表达瞬时表达：外源基因进入受体细胞后，未整合进受体细胞基因组而立即转转录，出现基因产物。瞬时表达是一种快速的研究基因表达、蛋白质亚细胞定位及基因间互作的一种重要手段，具有简单、快速、周期短、准确等优点。瞬时表达不受基因的位置效应和基因沉默的影响，表达效率较稳定，转化率高，不产生可遗传的子代，生物安全性高。表达载体的调控原件组成一、真核表达原件1.启动子：CMV，EF1a，SV402.调控序列：增强子、5’UTR，3’UTR，MAR序列等3.多克隆位点（MCS）4.PlolyA加尾信号5.筛选标记：Neomycin，puromycin，hygromycin二、原核调控原件1.复制起始位点2.筛选标记：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素等UbiquitousTissue-specificHybridPromoterMinimalPromoterSyntheticInsulatorLCRsS/MAUCOEAnti-repressorSTARelementEnh/PromEnh/Promcis-actingDNAelementscis-actingDNAelementsMCSReporter/antibioRMCSReporter/antibioRABCePromReporterbPromantibioRpAnSVCMVSV/EFCMV/EFGFPYFPGLucNeoHygroBlastiZeoGFP:ZeoSVenh/PromGFP2AEC2KZeopAnePromReporterbPromantibioRpAnSVCMVSV/EFCMV/EFGFPYFPGLucNeoHygroBlastiZeoePromReporterbPromantibioRpAnSVCMVSV/EFCMV/EFGFPYFPGLucNeoHygroBlastiZeoGFP:ZeoSVenh/PromGFP2AEC2KZeopAnGFP:ZeoSVenh/PromGFP2AEC2KZeopAnSVenh/PromGFP2AEC2KZeopAn载体（Vector）游离型载体附着型载体MAR又称核骨架附着区（scaffoldattachmentregion,SAR）。S/MAR是存在于真核细胞染色质中的一段与核基质特异结合的DNA序列。MinicircleDNA标签蛋白（Tags）一、荧光蛋白：eGFP/eCFP/eYFP/mCherry二、荧光素酶三、Flag：DYKDDDDK四、HA：YPYDVPDYA五、c-Myc：Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu1.基因过表达方法（Overexpression）-稳定表达稳定表达：外源基因进入受体细胞后，整合进受体细胞基因组，持续表达基因产物。稳定表达的关键：整合进入基因组、高拷贝的维持和使用高效启动子慢病毒载体PiggyBacTransposonSystemPB（PiggyBac）转座系统中转座子PB来源于甘蓝蠖度尺蛾，其转座遵循“切离-粘贴”机制。PB特异地插入到TTAA四碱基位点，插入的同时在其两侧形成TTAA四碱基重复。PiggyBacTransposonSystem+phiC31SystemΦC31整合酶来源于链霉菌（Streptomyces）噬菌体ΦC31。链霉菌噬菌体ΦC31整合酶能够催化链霉菌基因组中attB位点和噬菌体基因组attP位点之间的同源重组phiC3System+质粒导入细胞的方法质粒导入细胞的方法质粒导入细胞的方法质粒导入细胞的方法2.RNA干扰（RNAinterfeerence）2.RNA干扰（RNAinterfeerence）RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。RNA干扰的原理①RNAi是转录后水平的基因沉默机制；②RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA；③RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量）就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的；④RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点；⑤dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割;⑥ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。RNA干扰的特征RNA干扰的一般流程siRNA的设计siRNA的设计siRNA的设计RNA干扰的表达载体二、基因组编辑技术为什么（Why）要对基因组进行编辑？基因组编辑的应用PatrickD,etal.,Cell,2014常用的基因组编辑技术一、基因打靶技术二、锌指核酸酶技术（Zincfingernucleases,ZNFs）三、转录激活子样效应因子核酸酶技术（TranscriptionActivatorLikeEffector,TALENs）四、成簇的间隔短回文重复序列系统（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeat,CRISPR/Cas）五、DNA-guidedgenomeediting:NgAgo(韩春雨)，Structure-guidedendonuclease目前使用的基因组定点编辑技术Thedevelopmentofgenomeeditingtechnologies2005，Highlyefficientendogenoushumangenecorrectionusingdesignedzinc-fingernucleases.Nature435,646–651.2010，TargetingDNAdouble-strandbreakswithTALeffectornucleases.Genetics186,757–761.1987-1989，第一只基因敲除小鼠诞生2013，MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.Science339,819-823.基因组编辑技术的发展MarioR.CapecchiMartinJ.EvansOliverSmithies他们的获奖原因是其研究为“基因靶向”技术的发展奠定了基础。这种技术利用胚胎干细胞，改造老鼠体内的特定基因。在“基因靶向”技术的帮助下，科学家可以使实验鼠体内的一些“不活跃”基因失去作用，从而发现这些基因的实际功能。科学家希望借此发现人类一些疑难杂症在分子水平上的发病原因，并最终找到治疗途径。一、基因打靶是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段，它的产生和发展建立在胚胎干细胞（EmbryonicStemCell,ES）技术和同源重组技术成就的基础之上。基因打靶技术将广泛应用于基因功能研究、人类疾病动物模型的研制以及经济动物遗传物质的改良等方面。基因打靶同源重组（HomologousRecombination)同源重组是指发生在姐妹染色单体（sisterchromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。GeneknockoutmiceGeneknockoutmice1.操作复杂,实验周期长,费用偏高；2.重组率低；3.在敲除过程中,被破坏的常常只是靶基因的部分外显子而并不是整个编码区,残留的编码序列有可能组合出新的未知的功能,这将给表型分析带来麻烦；4.对于某些必需基因,敲除后会造成细胞死亡,也就无法研究这些必需基因的功能;5.由于基因功能上的冗余,敲掉一个基因并并不能造成容易识别的表型,基因家族的其他成员可以提供同样的功能;6.同一个打靶载体在不同遗传背景下进行基因敲除,获得的表型差异很大。Geneknockoutproblems反式作用因子的DNA结合结构域：螺旋/转角/螺旋